14
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
dapat dilakukan dengan menggunakan resin TALON. Protein RNA helikase yang berikatan dengan resin TALON setelah dilakukan pencucian, lalu
dielusi sehingga diperoleh RNA helikase yang lebih murni. Pemurniaan ini dapat dilakukan dengan menggunakan imidazol dalam buffer B karena
mempunyai keuntungan yaitu dapat mempertahankan protein kondisi asli native condition maupun kondisi denaturasi Utama et al, 2000.
2.7. SDS PAGE
Elektroforesis merupakan studi tentang pergerakan molekul muatan dalam medan listrik. Media yang digunakan adalah selulosa atau gel tipis
terdiri dari poliakrilamida atau agarosa. Selulosa digunakan sebagai media untuk penetapan nilai berat molekul yang rendah seperti asam amino dan
karbohidrat sedangkan agarosa dan gel poliakrilamid banyak digunakan untuk molekul yang besar seperti protein.
Teknik-teknik elektroforesis pada umumnya tidak dapat digunakan untuk mengukur berat molekul dari molekul biologis karena mobilitas zat
dalam gel dipengaruhi oleh muatan dan ukuran. Oleh karena itu, jika sampel biologis diperlakukan sedemikian sehingga memiliki muatan yang seragam,
maka mobilitas elektroforesisnya hanya akan tergantung pada ukurannya saja. Berat molekul protein dapat diperkirakan dengan elektroforesis menggunakan
sodium dodesil sulfat SDS dan merkaptoetanol.
Gambar 5. Perangkat SDS PAGE GTB 204 Molecular Biology Protocols 2001
15
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
SDS mengukur struktur sekunder, tersier dan kuarterner protein untuk menghasilkan rantai polipeptida linier yang dilapisi molekul SDS bermuatan
negatif. Setiap 1,4 gram SDS mengikat per gram protein. Merkaptoetanol membantu denaturasi protein dengan mengurangi semua ikatan disulfida
GTB 204 Molecular Biology Protocols, 2001.
2.8. Uji ATPase
Enzim RNA helikase selain memiliki aktivitas RNA helikase ATP –
dependent helicase juga memiliki aktivitas ikatan RNA RNA binding dan ATPase RNA stimulated ATPase. Karena aktivitas RNA tergantung ATP
maka uji ATPase dapat dilakukan dalam skrining inhibitor RNA helikase Utama et al, 2000.
Uji ATPase dapat dilakukan dengan kolorimetrik ATPase. Uji ini digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak berwarna,
misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang tidak dapat menyerap cahaya. Dalam uji ini menggunakan pereaksi yang berwarna
malachite green dan ammonium molibdat tetrahidrat. Jadi prinsip dari kolorimetrik ini adalah perubahan warna yang muncul sebagai akibat adanya
reaksi antara zat yang tidak berwarna ditambah dengan pereaksi sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Dalam uji kolorimetrik ini
membutuhkan blanko aquadest, master mix, dan pereaksi warna yang mendapatkan perlakuan sama dengan perlakuan terhadap sampel, blanko ini
digunakan sebagai faktor pengoreksi absorbansi dalam uji ATPase Utama et al, 2000.
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3 METODOLOGI
3.1. Waktu dan Tempat Penelitian
3.1.1. Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juni 2012 sampai dengan Desember 2012.
3.1.2. Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Natural Product Chemistry, Laboratorium Medicinal Chemistry UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta, Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong, Bogor dan Herbarium Bogoriense Bidang
Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor.
3.2. Alat dan Bahan
3.2.1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : timbangan analitik, alat-alat gelas, rotary evaporator, autoklaf, laminar air
flow LAF, lemari pendingin, inkubator goyang, vortex, centrifuge, sonikator, rotator, micropipet, microplate reader Multiscan EX,
waterbath, magnetic stirer, termometer, perangkat SDS-PAGE.
3.2.2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah biji jintan hitam Nigella sativa L., sel Escherichia coli BL21 DE3 pLysS
– RNA helikase HCV rekombinan, n-heksan teknis, etil asetat teknis, metanol
teknis, metanol p.a., media Luria-Bertani LB yeast extract powder HIMEDIA
®
, NaCl MERK
®
dan Tryptone OXOID
®
, 100µgml ampisilin, 0,3 mM IPTG Isopropyl-
β-D-Thiogalactoside, resin TALON, buffer B 10 mM tris-HCl, 0,25 Tween 20, buffer elusi buffer B, imidazol, loading
