12
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
Tabel II.1. Inhibitor RNA Helikase HCV
kemudian diberi nama DNA helikase atau RNA Helikase. RNA helikase pertama kali ditemukan pada E.coli, dan juga ditemukan pada bakteri,
khamir, dan virus. Pada HCV enzim ini dikodekan oleh NS3 RNA Helikase. Enzim ini diperlukan dalam replikasi HCV. RNA helikase HCV memiliki
tiga aktivitas yaitu mengikat rantai RNA, menghidrolisi ATP dan membuka ikatan dupleks antar RNA dari 3’ - 5’. RNA helikase merusak ikatan
hidrogen antara RNA berpasangan. Reaksi enzimatis tersebut memerlukan energi yang diperoleh dari hidrolisis ATP menjadi ADP dan P dan juga
kation divalen seperti Mg
2+
Kadare Haenni, 1997. Mekanisme kerja RNA helikase dapat dilihat dari gambar sebagai berikut :
Inhibitor dapat menghalangi pengikatan ATP pada enzim RNA helikase sehingga enzim RNA helikase tidak mempunyai energi untuk
membuka untai rantai ganda RNA. Selain itu inhibisi juga dapat dilakukan terhadap salah satu aktivitas RNA helikase yang secara tidak langsung akan
menghambat kerja RNA helikase karena RNA helikase membutuhkan ketiga macam aktivitas tersebut. Inhibitor dapat diberikan untuk
menghalangi aktivitas pengikatan RNA sehingga RNA tidak dapat membuka untai rantai ganda. Inhibitor juga dapat diberikan untuk
menghalangi pembukaan untai RNA, misalnya dengan cara menghambat proses hidrolisis ATP sehingga RNA tidak mempunyai energi untuk
membuka untai ganda RNA Utama et al, 2000.
2.5. Inhibitor RNA Helikase HCV
INHIBITOR PERSEN
INHIBISI DAFTAR
PUSTAKA 1 Protein kapang endofit CgKTm SF
89,45 Paturohman, 2011
2 Ekstrak metanol buah tanaman
mangrove Avicennia marina Forsk Vierb.
76,705 Kusumawati, 2011
3 Bakteriosin asam laktat S34 64,20
Putri, 2011
a
13
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
4 Mikroalga BTM 11 81,205
Putri, 2011
b
5 Ekstrak rimpang temulawak
Curcuma zanthorrhiza Roxb. 73,60
Setianingsih, 2011
2.6. Ekspresi dan Purifikasi RNA Helikase HCV
Sebagai langkah awal untuk melakukan ekspresi RNA helikase hepatitis C ini, E.coli BL21 DE3 pLysS yang telah tersisipi gen penyandi
RNA helikase HCV ditumbuhkan di dalam medium LB cair yang ditambahkan ampisilin. Selanjutnya medium tersebut diinkubasi selama 30
menit, setelah OD
600
mencapai 0,3 saat pertumbuhan bakteri mencapai fase log,
kemudian diinduksi
dengan IPTG
isopropyl- β-D
thiogalactopyranoside. IPTG berperan dalam menginduksi sel bakteri sehingga ekspresi protein rekombinan dapat maksimal Sambrook, 2001.
IPTG yang sudah masuk ke dalam sel tidak akan dimetabolisme karena IPTG ini bertindak bukan sebagai substrat, sehingga konsentrasi IPTG tetap
konstan. Setelah dilakukan penambahan IPTG selanjutnya kultur E.coli tersebut diinkubasi hingga fase stasioner yaitu fase yang tidak terdapat
penambahan atau pengurangan jumlah sel bakteri tapi fungsi sel terus berlanjut seperti metabolisme sekunder dan proses biosintesis Utama et al,
2000. Sentrifugasi dilakukan untuk pemisahan medium yang digunakan
dalam kultur dengan sel bakteri, dan dilakukan pada suhu 4
o
C untuk mencegah denaturasi protein. Lalu untuk tahap purifikasi digunakan pelet
yang di dalamnya terdapat protein RNA helikase HCV. Purifikasi RNA helikase dilakukan dengan menggunakan modifikasi
dari metode immobilizied metal chromatography IMAC. Prinsip metode ini adalah berdasarkan pada interaksi bolak-balik antara asam amino rantai
samping dan ion immobilizied. Berbagai rantai samping seperti histidin, sistein, dan triptopan dapat berikatan dengan ion metal immobilizied.
Protein RNA diberi label 6xHis-tag label protein dengan 6 histidin. Ion nikel Ni
2+
, tembaga Cu
2+
, dan kobalt Co
2+
memiliki afinitas yang besar terhadap histidin sehingga purifikasi protein RNA Helikase 6xHis-tag
14
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
dapat dilakukan dengan menggunakan resin TALON. Protein RNA helikase yang berikatan dengan resin TALON setelah dilakukan pencucian, lalu
dielusi sehingga diperoleh RNA helikase yang lebih murni. Pemurniaan ini dapat dilakukan dengan menggunakan imidazol dalam buffer B karena
mempunyai keuntungan yaitu dapat mempertahankan protein kondisi asli native condition maupun kondisi denaturasi Utama et al, 2000.
2.7. SDS PAGE
