21
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
3.3.7. Analisa angka kapang
3.3.7.1. Pembuatan Media Pembenihan
Sebanyak 39 gram serbuk Potato Dextrose Agar dilarutkan dengan 1 liter air suling dalam erlenmeyer menggunakan hotplate dan
magnetic stirer hingga diperoleh larutan yang jernih. Media ini kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121
o
C tekanan 15 lbs selama 15 menit Hadiotomo, 1990.
3.3.7.2. Pebuatan Sampel Uji dan Analisa Angka Kapang
Sebanyak 1 gram serbuk simplisia dilarutkan dalam 10 ml aquades steril sehinga didapatkan konsentrasi suspensi sebasar 10.
Dari stock yang ada diambil 1 ml pengenceran 10
-1
ke dalam tabung yang berisi pengenceran aquadest steril hingga diperoleh pengenceran 10
-2
lalu dibuat hingga pengenceran 10
-4
. Dari masing –masing pengenceran
diambil 0,5 ml, dituangkan pada permukaan PDA, segera digoyang sambil diputar, agar suspensi tersebar merata. Seluruh cawan diinkubasi
pada suhu 20 – 25
o
C selama 3 - 4 hari. Sesudah 3 hari inkubasi, dicatat jumlah koloni jamur yang tumbuh, pengamatan terakhir pada inkubasi
hari ke- 4. Koloni ragi dapat dibedakan dengan koloni kapang dari bentuknya yang bulat kecil berwarna putih hampir menyerupai bakteri.
Lempeng agar yang diamati adalah lempeng dimana terdapat 40 – 60
koloni kapang Hadiotomo, 1990.
3.3.8. Produksi enzim helikase HCV
3.3.8.1. Pembuatan Media
Media LB Luria-Bertani cair dibuat sebagai medaia untuk pertumbuhan E.coli BL21 DE3 pLysS-RNA helikase HCV
rekombinan. Media LB dibuat sebanyak 10 ml untuk prekultur dan 400 ml untuk kultur. Semua disterilisasi pada suhu 121
o
C selama 15 menit Utama et al, 2000.
22
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
3.3.8.2. Pembuatan larutan dapar
Pembuatan dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25. Dicampur menjadi satu dan
diaduk hingga homogen.
3.3.8.3. Ekspresi dan purifikasi RNA helikase HCV
.
a. Media LB 10 ml diberi ampisilin 100µgml sebanyak 10 µl dan
dihomogenkan. Lalu dimasukkan bakteri E.Coli BL21 DE3 pLsS yang membawa gen RNA helikase HCV, kemudian diinkubasi
selama satu malam dalam inkubator goyang pada suhu 37
o
C dengan kecepatan 200 rpm.
b. Hasil prekultur tersebut diinokulasi ke dalam 400 ml LB yang telah
diberi ampisilin dan ditambahkan IPTG 0,3 mM. Lalu diinkubasi dalam inkubator goyang pada suhu 37
o
C dengan kecepatan 200 rpm. c.
Hasil kultur E.coli BL21 DE3 pLysS yang dinkubasi selama 3 jam dalam inkubator goyang, pada suhu 37
o
C, dipindahkan ke dalam tabung-tabung sentrifus ukuran 50 ml, disentrifus dengan kecepatan
3500 rpm, selama 10 menit. Endapan dicuci dengan media LB, disentrifugasi kembali selama 10 menit dengan kecepatan 5000 rpm.
Pelet diambil dan dikumpulkan peletnya kemudian disimpan selama satu malam pada suhu -20
o
C. d.
Purifikasi RNA Helikase. Pelet yang disimpan pada suhu -20
o
C dilakukan freeze thawing atau pengeringbekuan sebanyak tiga kali.
Setelah itu disonikasi pemecahan sel dengan alat sonikator dengan amplitudo 45 , cycle 0,5, selama 15 detik dilakukan tiga kali
dengan interval masing-masing 1 menit. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 20 menit untuk menghasilkan
pelet. Kemudian pelet ditambahkan resin TALON 300 µl pada
rotator pada suhu dingin selama 3 jam. Lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Supernatan sebagai inner
volume IV diambil 50 µl untuk di analisa dengan metode SDS- PAGE, sedangkan pelet ditambahkan larutan buffer B sebanyak 10
23
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
ml, kemudian disentrifugasi kembali dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebanyak 50 µl sebagai washing
pertama W1 untuk analisa SDS-PAGE. Pelet ditambahkan kembali buffer B sebanyak 10 ml, lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebanyak 50 µl sebagai washing kedua W2 untuk SDS-PAGE. Pelet
dipindahkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml kemudian disentrifugasi 3000 rpm selama 2 menit. Pelet yang ada di dalam
eppendorf tube 1,5 ml ditambahkan buffer elusi sebanyak 200 µl kemudian di rotator pada suhu dingin semalaman. Setelah di rotator
semalaman, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit supernatan dipindahkan ke dalam eppendorf tube
1,5 ml lainnya sebagai E1elution pertama untuk analisa SDS- PAGE. Sedangkan pelet ditambahkan buffer elusi kembali sebanyak
200 µl, kemudian dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan dipisahkan dari peletnya
sebagai E2elution kedua untuk analisa SDS-PAGE Utama et al, 2000.
e. Analisa enzim helikase dengan SDS – PAGE
Enzim RNA helikase ini dianalisa kemurniannya dengan menggunakan SDS-PAGE. Glass plate sandwich short plate
spacer plate dibersihkan dengan alkohol 70. Short plate ditempatkan di depan kaca spacer plate. Kedua kaca tersebut
kemudian dimasukkan ke dalam casting frame dengan posisi bagian bawah kedua kaca sama rata lalu kunci dengan cams. Casting frame
dipasang pada casting stand. Setelah peralatan siap, larutan gel separating dibuat sesuai dengan prosedur Lampiran 6a.
Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate spacer plate
sampai dua per tiga bagian lalu ditambahkan aquades sampai dengan batas atas kaca, kemudian ditunggu ± 20 menit sampai terbentuk gel.
Selama menunggu 20 menit, larutan gel stacking dibuat sesuai dengan prosedur Lampiran 6b.
Sebelum gel stacking dimasukkan,
24
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
air yang ada pada gel separating dibuang. Larutan gel stacking dituang sampai batas atas kaca, comb dimasukkan, kemudian
ditunggu ± 20 menit sampai gel memadat. Setelah gel memadat, gel dipindahkan dari casting frame
dengan cara menekan cams pada casting frame. Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short
plate menghadap ke dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame.
Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution buffer elektroforesis SDS 1x pH 8.3.
Masing-masing sampel IV, W1, W2, E1, E2 diambil 4 µl lalu dimasukkan ke dalam eppendorf tube 1,5 ml dan ditambahkan
Loading dye Lampiran 6c kemudian didenaturasi pada suhu 95
o
C selama 10 menit. Marker precision plus protein standard sebanyak 4
µl dimasukkan ke dalam well. Sampel yang telah didenaturasi dimasukkan masing-masing sebanyak 5 µlwell. Kemudian gel
dirunning pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam dalam commasie Blue G
–250 staining solution Lampiran 6d selama 1 jam sambil digoyang-goyang diatas rocker. Gel dibilas
dengan commasie blue G –250 destaining solution Lampiran 6e
± 20 menit, dengan dua kali pengulangan. Gel dibilas dengan H
2
O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4
o
C.
3.3.8.4. Uji aktivitas ATPase RNA Helikase HCV
Kategori