32
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
mengendap sebagai pelet sedangkan media LB akan terpisah sebagai supernatan. Pelet yang telah terkumpulkan disimpan pada suhu -20
o
C untuk menghindari kerusakan pada sel dan menjaga stabilitas enzim RNA
helikase HCV Schwen Melling, 1985.
4.5.2. Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV
Purifikasi enzim RNA helikase HCV dilakukan untuk memurnikan hasil ekspresi enzim RNA helikase HCV yang telah disisipkan dalam
bakteri E.coli BL21DE3 pLySs. Enzim dipurifikasi dengan pemecahan sel terlebih dahulu.
Pemecahan sel ini berlangsung dengan menggunakan dua tahap yaitu dengan
cara pengeringbekuan
freeze thawing
dan sonikasi.
Pengeringbekuan menyebabkan pembentukan kristal es pada sel E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV. Kristal es terbentuk akibat
dilakukannya pengeringbekuan yang berlangsung berulang terhadap cairan intraselular dan cairan ekstraselular. Proses inilah yang memudahkan
pemecahan sel Schwen Melling, 1985. Pemecahan sel tahap kedua menggunakan sonikasi yang bertujuan
untuk memecah dinding sel. Dengan sonikasi ini menyebabkan organel dalam sel keluar namun tidak merusak integritas fungsionalnya. Pada saat
melakukan sonikasi ini pelet ditambahkan buffer B yang mengandung 10 mM Tris HCl pH 8,5 ; 100 mM NaCl dan 0,25 Tween 20. Tris HCl pH
8,5 ini berfungsi untuk mempertahankan aktivitas enzim selama proses purifikasi enzim. Tween 20 digunakan untuk menghancurkan lipid bipolar
pada membran sel. Lipid bipolar ini berasosiasi dengan kompleks replikasi sehingga enzim RNA helikase melekat pada membran metabolit
intraselular. Dengan rusaknya lipid bipolar akan menyebabkan disosiasi bagian hidrofobik enzim RNA helikase dengan membran sel. Sedangkan
NaCl berfungsi untuk menghilangkan asam nukleat dan kontaminan lainnya yang berikatan tidak spesifik dengan RNA helikase HCV dengan cara
interaksi ionik Vanz et al, 2008.
33
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
Setelah dilakukan sonikasi, selanjutnya dilakukan sentrifugasi dan mengambil supernatannya. Supernatan ini berisi metabolit intraselular yang
perlu dimurnikan. Pemurnian ini dilakukan dengan metode kromatografi afinitas. Metode pemurnian ini menggunakan resin TALON afinitas logam
metal afinity yang secara spesifik dapat mengikat RNA helikase yang telah dilabel dengan 6xHis-Tag pada N terminalnya. Pengikatan residu His ini
dilakukan oleh logam Co
2+
yang terdapat pada resin TALON. Menurut Petty 1996, histidin akan berikatan secara selektif dengan logam Co
2+
resin TALON meskipun dalam resin tersebut terdapat ion metal bebas lainnya.
Pengikatan ini dilakukan di rotator. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan metabolit intraseluler lainnya melalui
sentrifugasi. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Resin
yang telah berikatan dengan enzim, dimurnikan kembali dengan pencucian menggunakan buffer B. Pencucian ini dimaksudkan untuk menghilangkan
protein non target. Pemurnian berikutnya, pengikatan imidazole yang terdapat dalam buffer elusi dengan resin TALON, sehingga enzim akan
terlepas dari ikatan resin. Konsentrasi imidazole lebih dari 200 mM menyebabkan protein yang memiliki residu His-tag terdisosiasi karena tidak
mampu lagi bersaing untuk berikatan dengan resin. Setiap hasil sentifugasi pada tahap pemurnian enzim dikoleksi untuk
dianalisis dengan menggunakan metode SDS-PAGE. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui kemurnian enzim. SDS-PAGE merupakan teknik yang
digunakan untuk menganalisis bobot molekul suatu protein. Prinsip kerjanya adalah pemisahan berdasarkan migrasi protein pada media penyangga.
Komposisi SDS-PAGE ini adalah akrilamid, Tris HCl, H
2
O, tetrametina- diamina dan ammoium persulfat. Akrilamid berguna untuk pembentukkan
gel, Tris HCl sebagai inisiator dalam proses polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid. Sedangkan tetrametina-diamina berguna sebagai katalisator
reaksi polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid. Untuk pewarnaan hasil SDS-PAGE digunakan pereaksi warna commasie blue dan destain for
34
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
37 kDa 50 kDa
75 kDa
100 kDa 150 kDa
250 kDa commasie sebagai pembilasnya sehingga dapat menampakkan pita protein
sesuai ukuran target yang diinginkan.
Dari hasil SDS-PAGE, enzim RNA helikase HCV yang telah dipurifikasi dalam penelitian ini mempunyai ukuran protein sebesar 54 kDa
yang ditunjukkan pada Gambar 7 dengan marker sebagai pembandingnya. Bobot molekul enzim ini sesuai dengan bobot enzim yang dilaporkan Utama
et al 2000. Sehingga dapat disimpulkan bahwa protein dalam E1 adalah enzim RNA helikase murni. Inner volume IV merupakan larutan yang
diambil setelah dilakukannya proses pemecahan sel, namun belum dilakukan tahap purifikasi dengan penambahan resin TALON sehingga
masih terdapat metabolit intraseluar yang belum termurnikan. Untuk lajur W1 washing 1 dan W2 washing 2 tidak menunjukkan adanya pita protein
yang artinya pada proses ini tidak terbawa enzim RNA helikase virus hepatitis C. Sedangkan untuk E1 elution 1 dan E2 elution 2 merupakan
hasil elusi enzim yang dilakukan dua kali. Pada Gambar 7 menunjukkan
54 kDa
Gambar 7. Elektroforesis SDS-PAGE RNA Helikase. M : Marker, E :
Enzim, IV : Inner Volume, W : Washing
M E1
E2 IV
W1 W2
35
UIN Syarif Hdayatullah Jakarta
bahwa E1 dan E2 memiliki pita protein yang sama ukurannya, hanya pada E1 pita tampak lebih tebal dikarenakan konsentrasi enzim yang lebih tinggi
pada proses elusi yang pertama.
4.6. Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Jintan Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV
