39
3.3. Metode 3.3.1. Pembuatan Ekstrak Batang Sipatah-patah ESP
Pembuatan ESP dilakukan di Laboratorium Biofarmaka IPB Taman Kencana, Bogor. Bagian batang tanaman sipatah-patah dipotong-potong
dengan panjang sekitar 1 cm, lalu diangin-anginkan sehingga menjadi kering. Bagian tanaman yang sudah kering dimasukkan ke dalam oven pada suhu
60°C selama 48 jam. Setelah kering kemudian dihaluskan dengan penggilingan sehingga menjadi serbuk. Selanjutnya proses pembuatan
ekstrak dari serbuk dilakukan di Laboratorium Farmasi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi, FKH IPB. Proses pembuatan ESP secara rinci ada di
Lampiran 3.
3.3.2. Analisis Kandungan Kalsium dan Fosfat, Bahan Aktif dan Analisis Senyawa Fitokimia Batang Sipatah-patah
Analisis kandungan mineral kalsium dan fosfor sipatah-patah dilakukan dengan uji proksimat berdasarkan metode AOAC 1980 Lampiran 4.
Analisis bahan aktif sipatah-patah menggunakan Gas Chromatography-Mass Spectrophotometry
GC-MS FAMES1 M dilakukan di Laboratorium Pemeriksaan Doping dan Kesehatan Masyarakat, Jakarta Lampiran 5.
3.3.3 Pembagian Kelompok Tikus
Penelitian ini dilakukan dengan membagi tikus percobaan menjadi dua kelompok yaitu: 1. Kelompok tikus nonovariektomi NOV untuk meneliti
kemampuan ESP terhadap pencegahan osteoporosis pada masa prepubertas, 2. Kelompok tikus ovariektomi OV untuk meneliti aktivitas ESP terhadap
pengobatan osteoporosis pada tikus betina yang diovariektomi. Masing-masing kelompok diberi ekstrak sipatah-patah dengan dosis 750 mgkg bbhariper oral
sesuai penelitian Shirwaikar et al. 2003.
3.3.4 Kelompok Tikus Nonovariektomi NOV
Penelitian pada kelompok tikus nonovariektomi ini bertujuan untuk meneliti kemampuan ESP untuk memperbaiki kondisi tulang sehingga dapat
mencegah terjadinya osteoporosis di kemudian hari. Sebelum percobaan dimulai, semua tikus diadaptasikan di lingkungan kandang percobaan selama
40 10 hari untuk tiap-tiap kelompok perlakuan. Setelah masa adaptasi, hewan coba
dibagi secara acak dalam lima grup perlakuan dan masing-masing diberi ekstrak sipatah-patah setiap hari selama penelitian. Penelitian ini menggunakan 20 ekor
tikus betina Rattus norvegicus galur Sprague Dawley umur 20 hari dengan bobot badan 95-100 g sebagai hewan coba. Tikus diberi pakan standar dan air
minum ad libitum. Hewan coba ditempatkan di dalam kandang individu dan diadaptasikan terhadap pakan dan lingkungan selama 10 hari.
Tikus-tikus pada grup kontrol diberi larutan karboksimetil selulosa CMC 1 sebagai plasebo NOV-0, sedangkan tikus grup perlakuan diberi ESP mulai
umur 30 hari NOV-1, 60 hari NOV-2, 90 hari NOV-3, dan 120 hari NOV-4. Pada tikus-tikus grup perlakuan ESP diberikan per oral dengan feeding tube
sebanyak satu mililiter ESP satu hari sekali yaitu pagi hari jam 08.00 wib dengan dosis 750 mgkgBBhari selama masa penelitian.
Penimbangan bobot badan dilakukan setiap 15 hari sekali. Pengambilan darah kurang lebih 2 ml
dilakukan setiap 30 hari sekali melalui vena coccygeae. Darah dikoleksi pada
tabung reaksi dan selanjutnya dianalisis kadar kalsium dan fosfor. Analisis kadar kalsium dan fosfor dilakukan di Fakultas Peternakan Institut Pertanian Bogor,
dengan mengunakan Atomic Absorbance Spectrophotometry AAS
Hitachi
®
5000 untuk kalsium, sedangkan untuk analisis kadar fosfor menggunakan metode spectrophotometry dengan alat Spectronic Camspecs
®
Pada akhir masa perlakuan pada umur tikus 180 hari, semua tikus dikorbankan dengan cara dislokasi tulang leher. Kemudian dilakukan nekropsi
untuk pengambilan kerangka tulang dan organ untuk diamati secara histologis . Pengamatan selanjutnya adalah pemeriksaan radiografi terhadap kondisi tulang
yang dilakukan setelah organ visceral dikeluarkan. Semua organ termasuk tulang diambil dan difiksasi dengan larutan formalin 10 . untuk proses
pembuatan sediaan histologi. Selanjutnya ossa radius-ulna kiri serta ossa vertebrae lumbalis II-V diambil untuk dianalisis kadar kalsium dan fosfat. Ossa
tibia-fibula kanan, ginjal, hati, dan kelenjar paratiroid diambil untuk pembuatan sediaan histologis. Sampel tulang tibia-fibula difiksasi dalam larutan pengawet
paraformaldehid 4 dan dilakukan dekalsifikasi dalam larutan asam nitrat 5 , selanjutnya tulang diproses dengan metode histokimia standar Humason
1967 dan ditanam dalam blok parafin. Sayatan jaringan ginjal, hati, dan kelenjar paratiroid serta ossa tibia-fibula diwarnai dengan pewarnaan HE
Humason 1967 dan pewarnaan MT Kiernan 1990 Lampiran 8. LW-200 Lampiran 7.
41
3.3.5 Kelompok Tikus Ovariektomi OV
