Sigma Chemical, USA, serta alkohol 70 . Sel limfosit didapat dan diisolasi dari darah responden laki-laki dewasa yang sehat.
2. Alat
Alat untuk analisis kultur sel dan pengujian kandungan total fenolik meliputi, laminar flow lab.gard Class II, Type AB2, model NU-407-
600, inkubator C0
2
water jacketed incubator, model NU-2700E, sentrifuse
jenis swing dengan tipe CR412 dari Jouan, hemasitometer Neubauer, I3-counter Beckman, mikroskop Zeiss ID03, Germany,
mikropipet, neraca analitik, tabung reaksi, pipet Mohr 2ml dan 10 ml, corong, vorteks, lampu spiritus, serta spektrofotometer. Pengamatan dari
foto sel menggunakan inverted microscope tipe 1x70 dari Olympus dengan pembesaran lensa obyektif 100x. Pembacaan absorbansi jumlah sel
menggunakan alat microplate reader Benchmark, Bio-Rad. Peralatan habis pakai yaitu lempeng sumur mikrotiter 96 Nunc,
tabung Falcon 5 ml, tabung 1,5 ml Eppendorf, tabung vakum vacutaener
9 ml, syringe dengan jarum butterfly No. 23, membran filter 0,22
μm, mikrotip biru dan kuning, alumunium foil, kertas saring Whatman no.1.
B. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN
Penelitian ini dilakukan dari bulan Februari sampai Mei 2006. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi
Pangan ITP, Fakultas Teknologi Pertanian IPB dan Laboratorium Kultur Jaringan, Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi
KRP, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.
C. METODE PENELITIAN
1. Ekstraksi
Sebanyak 8 gram bubuk kakao diekstraksi dalam 100 ml pelarut air H
2
O sehingga konsentrasinya menjadi 0,08 gml selama 24 jam pada suhu kamar. Kemudian disaring sebanyak 2 kali dengan kertas saring dan
dipisahkan antara ampas dan filtratnya. Sebanyak 1,5 ml masing-masing
filtrat sampel dijadikan larutan stok dan disterilkan secara aseptis dengan penyaringan membran 0,22
μm. Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dalam media RPMI 1640 untuk mendapatkan larutan stok
dengan tingkat konsentrasi masing-masing 1,66 mgml C
1
, 3,32 mgml C
2
dan 6,64 mgml C
3
. Tingkatan konsentrasi ini ditentukan berdasarkan konsumsi normal minuman bubuk kakao murni perhari yang
terserap ke dalam darah manusia, dimana konsentrasi tersebut diatas berturut-turut merupakan analogi dari 1x, 2x, dan 4x dosis normal per hari.
Contoh perhitungan dapat dilihat pada lampiran 2.
2. Analisis Total Polifenol
Penetapan kandungan total fenol dilakukan secara spektrofotometri berdasarkan metode Folin-Dennis dengan menggunakan asam tanat
sebagai standar. Dua mililiter filtrat ekstrak bubuk kakao 0,8 mgml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ke dalamnya ditambahkan
berturut-turut 1 ml pereaksi Folin yang telah diencerkan 10 kali dengan akuades dan 1 ml larutan Na
2
CO
3
60gL. Kurva standar dibuat dari sederet larutan standar asam tanat dengan konsentrasi 0 ppm hingga 50
ppm. Masing-masing 2 ml larutan standar dipipet, kemudian diperlakukan sama seperti contoh di atas. Blanko dibuat dari 2 ml akuades sebagai
pengganti filtrat sampel. Masing-masing campuran sampel, standar maupun blanko divorteks kemudian dibiarkan selama 30 menit pada suhu
ruang. Selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 760 nm.
3. Persiapan Media Kultur Sel
Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640 yang sudah mengandung glutamin 10 mM. Cara pembuatan larutan RPMI
medium standar adalah dengan melarutkan bubuk RPMI sebanyak 10,42 gram ke dalam akuabides sehingga diperoleh satu liter larutan, kemudian
ditambahkan 2 gram NaHCO
3
sebagai buffer dan 1 penicillin streptomycin sebagai antibiotik untuk mencegah kontaminasi Junge et al.,
1970. Larutan tersebut disterilkan dengan membran steril 0,22 μm. Jika
digunakan sebagai media pertumbuhan, komposisi medium ditambahkan 10 FBS steril Zakaria, 1997.
4. Pengujian Ekstrak terhadap Proliferasi Sel Limfosit Manusia
