Bubuk kakao pada penelitian ini diekstraks dengan akuades atau air yang dipilih sebagai pendekatan terhadap keadaan nyata konsumsi bubuk
kakao sehari-hari. Masyarakat biasanya membuat minuman kakao ataupun coklat dengan cara melarutkan bubuk kakao di dalam air untuk kemudian
dikonsumsi. Pemilihan pelarut air ini juga memudahkan pembuatan kultur karena seperti halnya air, media RPMI-1640 juga bersifat polar sehingga dapat
dengan mudah melarutkan suspensi limfosit dan ekstrak sampel. Ekstraksi dilakukan selama 24 jam dengan maksud agar komponen
polar termasuk polifenol yang terlarut didalam pelarut air akan lebih optimal. Selanjutnya dilakukan penyaringan sebanyak 2 kali dengan kertas saring
untuk memisahkan endapan yang terbentuk di dasar wadah, sehingga diperoleh larutan ekstrak sampel yang homogen. Konsentrasi yang dipilih
ketika melakukan ektraksi adalah sebesar 8 gram per 100 ml akuades.
B. TOTAL POLIFENOL
Polifenol merupakan salah satu senyawa antioksidan yang berasal dari golongan flavonoid yang sangat bermanfaat bagi kesehatan. Komponen-
komponen fenolik banyak terdapat pada pangan nabati atau sayuran dan buah- buahan. Senyawa tersebut mempengaruhi kualitas gizi pangan segar dan
olahan. Selain itu senyawa fenol dapat berfungsi sebagai antioksidan primer karena mampu menghentikan reaksi rantai radikal bebas pada oksidasi lipid
Kochlar dan Rossell, 1990. Komponen fenolik yang terdiri dari fenol sederhana, turunan asam
hidroksisinamat dan flavonoid memiliki molekul dasar yang sama yaitu memiliki minimal satu cincin aromatik dan satu gugus hidroksil sehingga
mudah untuk larut dalam pelarut polar. Komponen fenolik ini telah diketahui pula memiliki aktivitas antioksidan Shahidi, 1997. Krinsky 1992
mendefinisikan antioksidan sebagai senyawa yang melindungi sistem biologis, melawan efek-efek yang potensial dari proses atau reaksi yang dapat
menyebabkan oksidasi berlebihan. Menurut Shahidi 1997, senyawa fenolik sering terikat dalam protein,
alkaloid dan terpenoid serta cenderung untuk larut dalam air karena paling
sering terdapat bergabung dengan gula glikosida dan biasanya terdapat dalam rongga sel tumbuhan. Dengan demikian, ekstraksi dengan pelarut air seperti
yang dilakukan pada penelitian ini diduga mampu mengekstrak komponen polifenol dari sampel bubuk kakao yang kemudian akan memicu proliferasi
sel limfosit. Penentuan total polifenol dalam penelitian ini dilakukan secara
spektrofotometrik menggunakan standar asam tannat pada konsentrasi 5 ppm hingga 50 ppm. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 760 nm.
Hubungan antara konsentrasi polifenol asam tannat dan absorbansi hasil reaksi dapat dilihat pada gambar 3. Hasil analisis total polifenol pada sampel
ekstrak bubuk kakao berdasarkan persamaan kurva tersebut dapat dilihat pada gambar 4 berikut ini.
y = 0.0176x + 0.0791 R
2
= 0.9932
0.2 0.4
0.6 0.8
1 1.2
5 10
15 20
25 30
35 40
45 50
55
konsentrasi ppm ab
so rb
a n
si
Gambar 3. Kurva standar asam tannat.
37 .4
09
20 .9
3
4.96 6
35 .53
4
9. 96
6 12
.38 1
4.02 8
39 .4
55
29 .0
57 21
.7 2
7
5 10
15 20
25 30
35 40
45
A1 A2
B1 B2
C1 C2
C3 D1
D2 D3
Jenis sampel K
o n
s en
tr asi
p p
m
Gambar 4. Diagram kadar total polifenol rata-rata pada bubuk kakao
Keterangan : A1 = Edel muda
A2 = Edel masak B1 = Bulk muda
B2 = Bulk masak C1 = Buah Terserang Busuk Buah Phytopthora Tingkat Serangan Ringan
C2 = Buah Terserang Busuk Buah Phytopthora Tingkat Serangan Sedang C3 = Buah Terserang Busuk Buah Phytopthora Tingkat Serangan Berat
D1 = Buah Terserang Penggerak Buah Kakao Tingkat Serangan Ringan D2 = Buah Terserang Penggerak Buah Kakao Tingkat Serangan Sedang
D3 = Buah Terserang Penggerak Buah Kakao Tingkat Serangan Berat
Dari grafik diatas diketahui bahwa adanya serangan busuk buah mengakibatkan penurunan kandungan polifenol pada bubuk kakao yang
diperoleh dari buah tersebut. Serangan cendawan P. palmivora diduga telah merusak buah kakao sehingga mempengaruhi kandungan senyawa kimia
dalam bijinya. Serangan hama penggerak buah juga mempengaruhi kadar total
polifenol ekstrak bubuk kakao dimana semakin tinggi tingkat serangannya semakin rendah kadar polifenol Misnawi, 2005.
Kandungan total polifenol tertinggi pada sampel yang tidak terserang hama adalah pada sampel edel muda yaitu sebesar 37,4 ppm dan yang
terendah adalah sampel bulk muda yaitu sebesar 4,9 ppm. Menurut Mao et al. 2000, komponen fenolik larut air yang terkandung di dalam kakao jenis edel
lebih besar jumlahnya daripada jenis bulk. Meskipun demikian hal ini bergantung pada proses fermentasinya.
Misnawi 2005 mengatakan bahwa semakin masak buah kakao, semakin tinggi kandungan polifenolnya. Ini dikarenakan pada buah yang
masih muda, pembentukan senyawa polifenol dalam biji kakao masih belum sempurna. Hasil penelitian yang berbeda ini kemungkinan terjadi karena
sampel yang diujikan total polifenolnya bukan berupa sampel segar dari biji kakao, melainkan yang telah berbentuk bubuk. Dengan demikian mungkin
terjadi perubahan komposisi kimia termasuk kandungan polifenolnya selama proses pengeringan menjadi bentuk bubuk tersebut. Hasil penelitian
sebelumnya mendapatkan bahwa kandungan polifenol dalam biji kakao kakao lindak fermentasi dan tanpa fermentasi berkisar 50
− 180 gkg Misnawi et al., 2002 a,c.
C. APLIKASI KULTUR SEL
