1970. Larutan tersebut disterilkan dengan membran steril 0,22 μm. Jika
digunakan sebagai media pertumbuhan, komposisi medium ditambahkan 10 FBS steril Zakaria, 1997.
4. Pengujian Ekstrak terhadap Proliferasi Sel Limfosit Manusia
4.1. Isolasi Limfosit Darah Tepi
Pengambilan darah perifer dilakukan di Klinik Herba Dr. Effi Afifah Kampus Darmaga oleh seorang asisten tranfusi darah pada
jam 09.30. Setelah diberi inform of concern lampiran 9, darah diambil dari seorang responden pria dewasa sehat secara aseptis
dengan syringe dan jarum butterfly No. 23 sekali pakai. Sampel darah ditempatkan dalam tabung vakum vacutaener steril.
Limfosit manusia diisolasi dari darah perifer dengan sentrifugasi berdasarkan perbedaan densitas larutan ficoll-hypaque
sebesar 1,77 ± 0,001 gml. Pertama dilakukan pemisahan komponen seluler dengan sentrifugasi sampel darah pada 1500 rpm selama 5
menit. Bagian darah yang lebih berat sel darah merah berada di bagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah di bagian atas.
Lapisan buffy coat yang sebagian besar berisi sel limfosit dan berada diantara kedua lapisan itu diambil lalu ditambahkan media
RPMI basal hingga 14 ml. Pada tahap pemisahan selanjutnya suspensi limfosit dalam
media dilewatkan diatas larutan ficoll-hypaque secara perlahan sehingga terbentuk dua lapisan yang tidak bercampur. Kemudian
disentrifugasi pada 1800-2000 rpm selama 30 menit. Sel darah putih yang tidak bergranula agranulosit seperti
limfosit dan monosit mempunyai densitas lebih rendah dari larutan ficoll-hypaque sehingga berada sebagai lapisan di atas
permukaan ficoll dan tidak menembus ke bawah. Sedangkan granulosit dan sel darah merah terpisah di dasar tabung sentrifus
karena berdensitas lebih tinggi. Lapisan atas yang berisi sel limfosit dicuci
2 kali dengan media basal dan disentrifugasi pada
1500 rpm selama 5 menit, sehingga limfosit dalam presipitat terpisah dari platelet, monosit, plasma dan ficoll dalam
supernatan.
Gambar 1. Darah perifer dan Ficoll hypaque sebelum disentrifugasi
Keterangan : A Darah perifer B ficoll hypaque
Gambar 2. Hasil pemisahan leukosit
Sel limfosit tersebut dihitung dengan pewarnaan biru trifan pada hemasitometer. Suspensi limfosit dengan jumlah sel yang hidup di
atas 95 tersebut disiapkan dan dilakukan pengenceran dengan media basal yang mengandung serum sebanyak 10 . Hasil isolasi
sel limfosit dibuat menjadi suspensi dengan konsentrasi 10
6
selml.
4.2. Pengujian Aktivitas Proliferasi Menggunakan MTT
