lebih besar jumlahnya daripada jenis bulk. Meskipun demikian hal ini bergantung pada proses fermentasinya.
Misnawi 2005 mengatakan bahwa semakin masak buah kakao, semakin tinggi kandungan polifenolnya. Ini dikarenakan pada buah yang
masih muda, pembentukan senyawa polifenol dalam biji kakao masih belum sempurna. Hasil penelitian yang berbeda ini kemungkinan terjadi karena
sampel yang diujikan total polifenolnya bukan berupa sampel segar dari biji kakao, melainkan yang telah berbentuk bubuk. Dengan demikian mungkin
terjadi perubahan komposisi kimia termasuk kandungan polifenolnya selama proses pengeringan menjadi bentuk bubuk tersebut. Hasil penelitian
sebelumnya mendapatkan bahwa kandungan polifenol dalam biji kakao kakao lindak fermentasi dan tanpa fermentasi berkisar 50
− 180 gkg Misnawi et al., 2002 a,c.
C. APLIKASI KULTUR SEL
Kultur sel secara in vitro memerlukan kondisi lingkungan yang sama dengan keadaan lingkungan dalam tubuh sehingga proses biologis yang terjadi
dalam kultur sel dapat berlangsung mendekati keadaan sebenarnya dalam tubuh. Pendekatan terhadap kondisi lingkungan tubuh diperoleh dengan
aplikasi media pertumbuhan, pH, serta fase gas yang sesuai untuk pertumbuhan sel.
Pada penelitian ini jumlah sel limfosit hidup dalam suspensi yang digunakan dalam kultur ini adalah sebesar 10
6
selml. Menurut Freshney 1994, jumlah sel minimum untuk dapat bertahan hidup di dalam kultur sel
adalah sebanyak 1-2 x 10
6
selml. Suspensi limfosit yang digunakan untuk setiap sumur adalah sebanyak 80 µl, sedangkan volume akhir kultur sel per
sumur adalah 100 µl. Dengan jumlah sel limfosit hidup tersebut diharapkan sel limfosit akan mampu bertahan hidup dan melewati siklus hidupnya dengan
baik dalam waktu inkubasi selama 72 jam. Penentuan waktu inkubasi selama 72 jam dilakukan untuk mencegah
berkurangnya ketersediaan zat gizi yang dikonsumsi oleh sel limfosit akibat waktu inkubasi yang lama. Media RPMI akan berfungsi maksimal dalam
mengkultur sel limfosit selama 3 hari. Jika inkubasi kultur dilakukan lebih lama dari jangka waktu tersebut maka perlu dilakukan penyegaran media
termasuk penambahan glutamin Malole, 1990. Penentuan ekstrak bubuk kakao yang ditambahkan pada kultur
ditentukan berdasarkan pada perhitungan konsentrasi ekstrak yang akan berada dalam darah ketika konsumsi normal minuman bubuk kakao. Contoh
perhitungan konsentrasi ini dapat dilihat pada lampiran 2. Konsentrasi ekstrak berdasarkan konsumsi sehari-hari dilambangkan dengan C
1
yaitu sebesar 1,66mgml, kemudian dari konsentrasi ini dibuat peningkatan konsentrasi
sebanyak dua kali lipat yaitu sebesar 3,32 mgml C
2
, dan empat kali lipat yaitu sebesar 6,64 mgml C
3
. Pengujian ekstrak terhadap proliferasi sel limfosit secara in vitro
menggunakan beberapa taraf konsentrasi seperti ini telah banyak dilakukan. Hal ini dengan maksud untuk mengetahui signifikansi peningkatan dosis
konsumsi dengan efek respon proliferatif sel yang dihasilkannya. Beberapa penelitian yang telah dilakukan dengan penggunaan beberapa tingkat
konsentrasi ini diantaranya dilakukan pada sampel ekstrak cincau hijau Pandoyo, 2000 dan ekstrak jahe Yuana, 1998.
Analisis dengan metode MTT diujikan dengan menggunakan ketiga tingkat konsentrasi pada setiap jenis ekstrak bubuk kakao, namun untuk
analisis dengan metode biru trifan hanya digunakan ekstrak bubuk kakao pada konsentrasi 3,32 x 10
-3
gml. Jumlah sel hidup yang terdapat pada kultur setelah masa inkubasi
dilihat dengan metode MTT, dimana pengukuran dilakukan secara spektrofotometri. Jumlah sel hidup dapat dilihat dari absorbansi yang
ditunjukkan oleh microplate reader. Kemampuan sel limfosit utuk berproliferasi akibat penambahan ekstrak bubuk kakao ke dalam sampel akan
dilihat dengan membandingkan absorbansi yang dihasilkan oleh kultur dengan penambahan ekstrak dan kultur tanpa penambahan ekstrak kontrol. Metode
biru trifan dilakukan untuk mengetahui jumlah sel limfosit yang mati setelah masa inkubasi. Hal ini dilakukan untuk mengetahui kemampuan ekstrak
bubuk kakao untuk mempertahankan viabilitas sel limfosit.
Pada metode MTT galat dapat terjadi berupa kesalahan positif jika terdapat kontaminasi. Kontaminasi menyebabkan kristal formazan yang
terbentuk bukan saja diperoleh dari kerja enzim suksinat dehidrogenase yang dimiliki oleh sel limfosit hidup, tetapi juga dari sel mikroba kontaminan.
Kedua galat ini tentunya harus dapat dihindari semaksimal mungkin pada pelaksanaannya secara teknis.
Untuk menghindari kontaminasi, pembuatan kultur sel dilakukan secara aseptis di dalam laminar flow hood. Selain itu, pada media RPMI yang
digunakan juga ditambahkan antibiotik yaitu penicillin yang efektif menghambat bakteri gram positif maupun negatif, serta streptomycin yang
efektif menghambat bakteri gram positif dan negatif serta mycoplasma Junge et al.
, 1970 Beberapa ekstrak bubuk kakao yang ditambahkan pada kultur pada
penelitian ini ternyata mampu menyebabkan sel limfosit bertahan hidup secara baik dan mengalami proliferasi secara signifikan terhadap kontrol. Hal ini
dapat dilihat dari nilai absorbansi kultur dengan penambahan ekstrak yang lebih tinggi daripada kontrol. Hal tersebut akan dijelaskan lebih lanjut pada
sub bab berikutnya.
D. PENGUJIAN AKTIVITAS PROLIFERASI SEL LIMFOSIT
