WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN RANCANGAN PERCOBAAN

Sigma Chemical, USA, serta alkohol 70 . Sel limfosit didapat dan diisolasi dari darah responden laki-laki dewasa yang sehat.

2. Alat

Alat untuk analisis kultur sel dan pengujian kandungan total fenolik meliputi, laminar flow lab.gard Class II, Type AB2, model NU-407- 600, inkubator C0 2 water jacketed incubator, model NU-2700E, sentrifuse jenis swing dengan tipe CR412 dari Jouan, hemasitometer Neubauer, I3-counter Beckman, mikroskop Zeiss ID03, Germany, mikropipet, neraca analitik, tabung reaksi, pipet Mohr 2ml dan 10 ml, corong, vorteks, lampu spiritus, serta spektrofotometer. Pengamatan dari foto sel menggunakan inverted microscope tipe 1x70 dari Olympus dengan pembesaran lensa obyektif 100x. Pembacaan absorbansi jumlah sel menggunakan alat microplate reader Benchmark, Bio-Rad. Peralatan habis pakai yaitu lempeng sumur mikrotiter 96 Nunc, tabung Falcon 5 ml, tabung 1,5 ml Eppendorf, tabung vakum vacutaener 9 ml, syringe dengan jarum butterfly No. 23, membran filter 0,22 μm, mikrotip biru dan kuning, alumunium foil, kertas saring Whatman no.1.

B. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN

Penelitian ini dilakukan dari bulan Februari sampai Mei 2006. Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan ITP, Fakultas Teknologi Pertanian IPB dan Laboratorium Kultur Jaringan, Bagian Patologi, Departemen Klinik, Reproduksi dan Patologi KRP, Fakultas Kedokteran Hewan IPB.

C. METODE PENELITIAN

1. Ekstraksi

Sebanyak 8 gram bubuk kakao diekstraksi dalam 100 ml pelarut air H 2 O sehingga konsentrasinya menjadi 0,08 gml selama 24 jam pada suhu kamar. Kemudian disaring sebanyak 2 kali dengan kertas saring dan dipisahkan antara ampas dan filtratnya. Sebanyak 1,5 ml masing-masing filtrat sampel dijadikan larutan stok dan disterilkan secara aseptis dengan penyaringan membran 0,22 μm. Kemudian dilakukan pengenceran bertingkat dalam media RPMI 1640 untuk mendapatkan larutan stok dengan tingkat konsentrasi masing-masing 1,66 mgml C 1 , 3,32 mgml C 2 dan 6,64 mgml C 3 . Tingkatan konsentrasi ini ditentukan berdasarkan konsumsi normal minuman bubuk kakao murni perhari yang terserap ke dalam darah manusia, dimana konsentrasi tersebut diatas berturut-turut merupakan analogi dari 1x, 2x, dan 4x dosis normal per hari. Contoh perhitungan dapat dilihat pada lampiran 2.

2. Analisis Total Polifenol

Penetapan kandungan total fenol dilakukan secara spektrofotometri berdasarkan metode Folin-Dennis dengan menggunakan asam tanat sebagai standar. Dua mililiter filtrat ekstrak bubuk kakao 0,8 mgml dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ke dalamnya ditambahkan berturut-turut 1 ml pereaksi Folin yang telah diencerkan 10 kali dengan akuades dan 1 ml larutan Na 2 CO 3 60gL. Kurva standar dibuat dari sederet larutan standar asam tanat dengan konsentrasi 0 ppm hingga 50 ppm. Masing-masing 2 ml larutan standar dipipet, kemudian diperlakukan sama seperti contoh di atas. Blanko dibuat dari 2 ml akuades sebagai pengganti filtrat sampel. Masing-masing campuran sampel, standar maupun blanko divorteks kemudian dibiarkan selama 30 menit pada suhu ruang. Selanjutnya diukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 760 nm.

3. Persiapan Media Kultur Sel

Media yang digunakan untuk kultur sel adalah RPMI-1640 yang sudah mengandung glutamin 10 mM. Cara pembuatan larutan RPMI medium standar adalah dengan melarutkan bubuk RPMI sebanyak 10,42 gram ke dalam akuabides sehingga diperoleh satu liter larutan, kemudian ditambahkan 2 gram NaHCO 3 sebagai buffer dan 1 penicillin streptomycin sebagai antibiotik untuk mencegah kontaminasi Junge et al., 1970. Larutan tersebut disterilkan dengan membran steril 0,22 μm. Jika digunakan sebagai media pertumbuhan, komposisi medium ditambahkan 10 FBS steril Zakaria, 1997.

4. Pengujian Ekstrak terhadap Proliferasi Sel Limfosit Manusia

4.1. Isolasi Limfosit Darah Tepi

Pengambilan darah perifer dilakukan di Klinik Herba Dr. Effi Afifah Kampus Darmaga oleh seorang asisten tranfusi darah pada jam 09.30. Setelah diberi inform of concern lampiran 9, darah diambil dari seorang responden pria dewasa sehat secara aseptis dengan syringe dan jarum butterfly No. 23 sekali pakai. Sampel darah ditempatkan dalam tabung vakum vacutaener steril. Limfosit manusia diisolasi dari darah perifer dengan sentrifugasi berdasarkan perbedaan densitas larutan ficoll-hypaque sebesar 1,77 ± 0,001 gml. Pertama dilakukan pemisahan komponen seluler dengan sentrifugasi sampel darah pada 1500 rpm selama 5 menit. Bagian darah yang lebih berat sel darah merah berada di bagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah di bagian atas. Lapisan buffy coat yang sebagian besar berisi sel limfosit dan berada diantara kedua lapisan itu diambil lalu ditambahkan media RPMI basal hingga 14 ml. Pada tahap pemisahan selanjutnya suspensi limfosit dalam media dilewatkan diatas larutan ficoll-hypaque secara perlahan sehingga terbentuk dua lapisan yang tidak bercampur. Kemudian disentrifugasi pada 1800-2000 rpm selama 30 menit. Sel darah putih yang tidak bergranula agranulosit seperti limfosit dan monosit mempunyai densitas lebih rendah dari larutan ficoll-hypaque sehingga berada sebagai lapisan di atas permukaan ficoll dan tidak menembus ke bawah. Sedangkan granulosit dan sel darah merah terpisah di dasar tabung sentrifus karena berdensitas lebih tinggi. Lapisan atas yang berisi sel limfosit dicuci 2 kali dengan media basal dan disentrifugasi pada 1500 rpm selama 5 menit, sehingga limfosit dalam presipitat terpisah dari platelet, monosit, plasma dan ficoll dalam supernatan. Gambar 1. Darah perifer dan Ficoll hypaque sebelum disentrifugasi Keterangan : A Darah perifer B ficoll hypaque Gambar 2. Hasil pemisahan leukosit Sel limfosit tersebut dihitung dengan pewarnaan biru trifan pada hemasitometer. Suspensi limfosit dengan jumlah sel yang hidup di atas 95 tersebut disiapkan dan dilakukan pengenceran dengan media basal yang mengandung serum sebanyak 10 . Hasil isolasi sel limfosit dibuat menjadi suspensi dengan konsentrasi 10 6 selml.

4.2. Pengujian Aktivitas Proliferasi Menggunakan MTT

Sejumlah 80 µl suspensi limfosit dalam media lengkap dimasukkan secara acak ke dalam sumur lempeng mikro. Lalu ditambahkan berturut-turut ke setiap sumur masing-masing sejumlah 20 µl ekstrak senyawa polifenol yang telah disiapkan dengan konsentrasi 1,66 mgml C 1 , 3,32 mgml C 2 dan 6,64 mgml C 3 . Volume akhir setiap sumur lempeng mikro adalah 100µl. Sebagai kontrol ditambahkan 20 µl medium RPMI-1640 sebagai penganti ekstrak sampel sehingga mencapai volume yang sama, sedangkan sebagai kontrol positif ditambahkan 20 µl mitogen LPS dengan konsentrasi dalam kultur sebesar 5 μgml sebagai pengganti ekstrak sampel. Sumur lempeng mikro kemudian diinkubasi selama 72 jam dalam inkubator suhu 37 o C. Sekitar 4-5 jam sebelum masa inkubasi berakhir, pada setiap sumur ditambahkan MTT 5 mgml sebanyak 10 µl lalu dilanjutkan inkubasi selama 4 jam. Sumur lempeng kemudian dibaca oleh alat microplate reader setelah sebelumnya ditambahkan HCl-isopropanol 0,04 N sebanyak 100 µl pada setiap sumur untuk menghentikan reaksi. Nilai absorbansi hasil pembacaan menggunakan microplate reader bersifat proporsional terhadap jumlah sel yang hidup.

4.3. Pengujian Aktivitas Proliferasi Menggunakan Biru Trifan

Metode isolasi dan pembuatan kultur untuk pengujian aktivitas proliferasi menggunakan metode biru trifan sama dengan metode MTT, namun penghitungan jumlah sel dilakukan dengan bantuan pewarnaan biru trifan menggunakan hemasitometer. Penghitungan jumlah sel hanya dilakukan terhadap sel mati. Rumus perhitungan sel limfosit dengan menggunakan hemasitometer adalah sebagai berikut : N selml = A x FP x 10 4 Keterangan : N = jumlah sel limfosit per ml A = jumlah sel rata-rata per bidang pandang FP = faktor pengenceran =2, diperoleh dari pencampuran biru trifan : suspensi sampel = 1: 1 10 4 = konstanta volume hemasitometer

D. RANCANGAN PERCOBAAN

Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini untuk analisis dengan metode MTT adalah rancangan acak lengkap dengan dua faktor dan tiga ulangan. Model rancangannya adalah sebagai berikut : Yij = µ + Ai + Bj + ABij + éijk Dimana : Yij = variabel respon yang dipengaruhi µ = nilai rata-rata perlakuan Ai = pengaruh taraf i faktor A Bj = pengaruh taraf j faktor B Abij = pengaruh interaksi taraf ke-i faktor A dan taraf ke-j faktor B éij = galat perlakuan akibat tiga kali ulangan i = jenis konsentrasi j = jenis ekstrak bubuk kakao Sementara itu rancangan percobaan yang digunakan untuk analisis dengan metode biru trifan adalah rancangan acak lengkap dengan satu faktor dan dua ulangan. Model rancangannya adalah sebagai berikut : Yij = µ + τi + εij Dimana : Yij = variabel respon yang dipengaruhi µ = nilai rata-rata perlakuan τi = pengaruh ekstrak bubuk kakao taraf ke-i i = jenis ekstrak bubuk kakao εij = galat perlakuan akibat dua kali ulangan Data yang didapat kemudian dianalisis secara statistik dengan program komputer statistik untuk analisis sidik ragam ANOVA, yang dilanjutkan oleh uji lanjut Duncan SAS 6.0, dengan kontrol negatif kultur sel tanpa ekstrak dan kontrol positif LPS sebagai pembanding.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN A.

BUBUK KAKAO Pada penelitian ini sampel kakao yang digunakan telah berbentuk bubuk hasil pengolahan dari bagian biji kopi yang telah melalui proses pemeraman dan pengeringan. Sebelum dilakukan pengujian secara in vitro, dilakukan ekstraksi terhadap sampel bubuk kakao dengan tujuan untuk mengekstrak komponen polifenol yang dipercaya mampu memicu aktitivitas proliferasi sel tersebut. Bubuk kakao bebas lemak merupakan produk substandar hasil pengolahan biji kakao, dengan demikian nilai ekonomisnya relatif rendah jika dibandingkan dengan cocoa butter atau lemak coklat yang banyak diambil dan dimanfaatkan dari tanaman kakao. Meskipun demikian, bubuk kakao bebas lemak ini diketahui tetap memiliki kandungan polifenol yang tinggi. Hal ini mengakibatkan adanya kemungkinan potensi bubuk kakao tersebut sebagai imunomodulator. Kedua jenis kakao yaitu edel dan bulk dipilih karena merupakan dua jenis tanaman kakao yang banyak dibudidayakan di Indonesia. Kandungan polifenol kedua jenis kakao ini tidak jauh berbeda, namun proses fermentasi kemungkinan akan mengakibatkan perubahan kimiawi termasuk kandungan total polifenolnya. Proses fermentasi mengakibatkan beberapa perubahan kandungan polifenol kakao, diantaranya terjadi penurunan drastis kandungan polifenol larut air serta terjadi polimerisasi beberapa jenis konstituen seperti -- epikatekin menjadi komponen fenolik yang lebih besar bobot molekulnya misalnya prosianidin Shahidi dan Nacsk, 2003. Menurut Leniger dan Beverloo 1975 ekstraksi adalah metode pemisahan dimana komponen-komponen terlarut dari suatu campuran dipisahkan dari komponen yang tidak larut dengan pelarut yang sesuai. Metode paling sederhana untuk mengekstraksi padatan adalah dengan mencampurkan seluruh bahan dengan pelarut, lalu memisahkan larutan dengan padatan tidak terlarut.