17
Ekstrak buah takokak
Pelarutan dalam DMSO hingga
konsentrasi 200 mgml
Kultur bakteri Bacillus cereus
Pengenceran hingga ~10
5
cfuml Inokulasi 200 µl suspensi bakteri ke
200 ml media NA bersuhu 40-42°C
Penuangan 20 ml media berisi bakteri ke dalam cawan dan pembekuan media ± 1 jam dalam refrigerator
Pembuatan sumur berdiameter 5 mm
Penuangan 60 µl ekstrak ke dalam sumur
Inkubasi pada 37°C selama 24 jam Gambar 11. Diagram alir uji aktivitas antibakteri metode difusi sumur
b. Uji difusi sumur Shan et al. 2007 yang dimodifikasi
Ekstrak takokak dilarutkan dalam pelarut organik DMSO hingga diperoleh konsentrasi akhir 200 mgml. Kultur bakteri Bacillus cereus yang telah disegarkan sehari
sebelumnya diencerkan hingga ~10
5
CFUmL. Sebanyak 200 μL suspensi bakteri tersebut
kemudian diinokulasikan ke dalam 200 ml media NA cair yang bersuhu 40 °C – 42 °C
lalu dituang ke dalam cawan dengan volume masing-masing cawan berkisar antara 20-25 ml media. Media tersebut didiamkan selama ± 1 jam agar memadat lalu dibuat sumur
berdiameter 5 mm dengan kedalaman ±3-4 mm kemudian sebanyak 60 μL ekstrak
dituangkan ke dalam sumur tersebut. Pelarut organik DMSO digunakan sebagai kontrol negatif, dan antibiotik kloramfenikol 25 mgml DMSO digunakan sebagai kontrol
positif. Media kemudian diinkubasi selama ± 1 jam dalam refrigerator agar memudahkan ekstrak untuk berdifusi, kemudian kembali diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam. Aktivitas antibakteri dihitung dengan mengukur diameter zona bening yang dihasilkan di
sekitar areal sumur dan dinyatakan sebagai nilai DIZ diameter of inhibition zone. Uji difusi sumur dilakukan sebanyak tiga ulangan masing-masing duplo.
18
c. Uji nilai MIC dengan metode Macrodilution Wiegand et al. 2008 yang dimodifikasi
Nilai Minimum Inhibitory Concentratrion MIC dari ekstrak metanol buah takokak dihasilkan dengan menggunakan metode pengenceran macrodilution. Ekstrak buah
takokak terpilih dilarutkan dengan DMSO hingga konsentrasi 600 mgml sebagai larutan stok. Kemudian larutan stok ini diencerkan sesuai dengan konsentrasi yang telah
ditentukan seperti yang dapat dilihat pada Tabel 6. Setelah dibuat campuran ekstrak dan NB pada berbagai konsentrasi kemudian masing-masing campuran tersebut diambil
sebanyak 1 ml dan ditambahkan 1 ml kultur Bacillus cereus ~10
5
cfuml. Setelah penambahan bakteri dilakukan, secepatnya divorteks dan dihitung jumlah bakteri saat 0
jam dengan metode cawan tuang. Kemudian campuran ekstrak dan bakteri tersebut diinkubasi dalam shaker incubator suhu 37°C selama 24 jam pada kecepatan 150 rpm dan
kembali dihitung jumlah bakteri setelah 24 jam dengan metode cawan tuang. Nilai MIC diperoleh dengan membuat kurva hubungan antara persentase penghambatan dan
konsentrasi ekstrak yang diuji. Konsentrasi ekstrak terkecil yang menghasilkan persentase penghambatan 90 merupakan nilai MIC Cosentino et al. 1999. Uji nilai MIC
dilakukan sebanyak dua ulangan masing-masing duplo. Diagram alir pengujian nilai MIC dapat dilihat pada Gambar 12.
Tabel 6. Pembuatan larutan ekstrak untuk uji nilai MIC
Tahapan Konsentrasi
Ekstrak mgml
Sumber V ekstrak
yang diambil ml
V NB steril
ml Konsentrasi
Ekstrak Hasil Pengenceran
mgml Konsentrasi
Ekstrak saat Pengujian
mgml
1 600
Stok 1.5
1.5 300
150 2
300 Tahapan 1
0.5 0.5
150 75
3 300
Tahapan 1 1
1.5 120
60 4
120 Tahapan 3
1 1
60 30
5 120
Tahapan 3 0.5
1 40
20 6
60 Tahapan 4
0.5 1
20 10
4. Analisis profil KLT ekstrak buah takokak Gritter et al. 1991
