Ekstraksi Bertingkat Analisis profil KLT ekstrak buah takokak Gritter et al. 1991

14

b. Analisis Kadar Air SNI 01-2891-1992

Penetapan kadar air dilakukan dengan pengeringan menggunakan oven dengan dua kali ulangan masing-masing duplo. Analisis kadar air dilakukan terhadap dua jenis sampel, yaitu buah takokak segar dan tepung buah takokak. Tahapan pertama yang dilakukan adalah cawan yang akan digunakan dikeringkan dalam oven selama 15 menit kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Sebanyak 1-2 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan tersebut dan ditimbang. Selanjutnya, cawan berisi sampel dikeringkan dalam oven pada suhu 105°C selama 3 jam lalu didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Perlakuan terakhir diulangi terus hingga diperoleh berat kering yang relatif teta p berat dianggap tetap jika selisih berat sampel yang ditimbang ≤ 0.0005 g. Penetapan kadar air dapat dilakukan dengan menggunakan persamaan berikut. adar air g 100 g berat basah 1 2 100 Keterangan: W = berat sampel sebelum dikeringkan g W1 = berat sampel + cawan kosong setelah dikeringkan g W2 = berat cawan kosong g

c. Analisis Total Fenol Shetty et al. 1995 dengan modifikasi

Penentuan total fenol dilakukan untuk mengetahui kandungan senyawa fenolik pada sampel. Sebanyak 50.0 mg sampel kering dilarutkan dalam 2.5 ml etanol 95, kemudian divorteks. Setelah itu dilakukan sentrifuse terhadap campuran tersebut dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil sebanyak 0.5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian ke dalam tabung reaksi tersebut ditambahkan 0.5 ml etanol 95, 2.5 ml aquadest, dan 2.5 ml reagen Folin Ciocalteau 50. Campuran tersebut kemudian didiamkan selama 5 menit lalu ditambahkan 0.5 ml Na 2 CO 3 5 dan divorteks. Setelah itu, sampel didiamkan di ruang gelap selama satu jam, lalu dilakukan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 725 nm. Dalam penentuan total fenol ini digunakan asam galat yang dibeli dari Sigma-Aldrich sebagai standar. Standar asam galat dibuat dengan variasi konsentrasi antara 50-250 mgml. Penentuan total fenol dilakukan sebanyak dua ulangan masing-masing duplo.

2. Ekstraksi Bertingkat

Sebanyak 50 g tepung takokak ditambah dengan kombinasi pelarut yang pertama sebanyak dua kali volume tepung buah takokak, kemudian divorteks, disonikasi selama 15 menit, disentrifugasi pada 2000 rpm selama 5 menit, disaring dan diambil filtratnya. Sisa ampas kembali ditambahkan kombinasi pelarut yang kedua kemudian diekstrak hingga dihasilkan filtrat yang kedua, begitu seterusnya sehingga dihasilkan delapan buah filtrat ekstrak takokak. Filtrat tersebut kemudian dipekatkan menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 45°C kemudian dikeringkan dengan gas N 2 . Ekstraksi bertingkat dilakukan menggunakan kombinasi pelarut yang semakin meningkat kepolarannya. Masing- masing ekstrak diberikan kode untuk mempermudah pembahasan, semakin besar nomor ekstrak menunjukkan semakin polar pelarut yang digunakan saat proses ekstraksi. Kombinasi pelarut yang digunakan pada tahap ekstraksi dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 4. 15 Diagram alir tahap ekstraksi bertingkat dapat dilihat pada Gambar 9. Ekstraksi dibuat dalam tiga kali ulangan. Tabel 5. Kombinasi pelarut untuk ekstraksi Kode Ekstrak No. Urut Kombinasi pelarut Metanol : Air F1 1 1 : 0 F2 2 9.5 : 0.5 F3 3 9 : 1 F4 4 8.5 : 1.5 F5 5 8 : 2 F6 6 7 : 3 F7 7 6 : 4 F8 8 5 : 5 Sebanyak 50 gram tepung buah takokak Penambahan masing-masing 25 ml kombinasi pelarut sesuai urutan yang telah ditentukan pada Tabel 5 Pencampuran Sonikasi selama 15 menit Sentrifus pada 2000 rpm selama 5 menit Ampas Filtrat Pemekatan dengan rotavapor pada T 45°C Pengeringan ekstrak dengan gas N 2 Sebanyak 8 ekstrak buah takokak Penyaringan dengan kertas saring Gambar 9. Diagram alir ekstraksi bertingkat 16

3. Analisis aktivitas antibakteri

a. Persiapan kultur Bacillus cereus

Persiapan kultur dilakukan dengan terlebih dahulu menguji keseragaman kultur Bacillus cereus dengan pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram dilakukan di atas kaca preparat. Kultur disebar di atas kaca sehingga terbentuk lapisan tipis kemudian difiksasi dan ditambahkan pewarna ungu kristal didiamkan selama 2 menit dan dibilas. Selanjutnya ditambahkan larutan lugol didiamkan selama 1 menit dan kembali dibilas dengan alkohol, terakhir ditambahkan pewarna merah safranin, dan dikeringkan. Morfologi bakteri dilihat menggunakan mikroskop hingga pembesaran 1000x. Sel bakteri dengan morfologi berwarna ungu merupakan bakteri Gram-positif, sedangkan sel bakteri dengan morfologi berwarna merah merupakan bakteri Gram-negatif Madigan et al. 2003. Selanjutnya dilakukan perhitungan total kultur bakteri uji menggunakan metode Aerobic Plate Count APC untuk mengetahui jumlah total bakteri awal sehingga dapat diketahui jumlah pengenceran yang diperlukan agar jumlah bakteri saat pengujian lebih seragam. Tahap persiapan kultur bakteri dapat dilihat pada Gambar 10. Sebanyak 1 ose bakteri Bacillus cereus diinokulasikan pada 5 ml NB steril kemudian diinkubasikan pada suhu 37°C selama 24 jam. Kultur bakteri ini yang selanjutnya digunakan dalam pengujian. Media NB yang telah berisi bakteri kemudian diencerkan pada seri pengenceran 10 2 -10 6 dan ditumbuhkan pada media NA serta diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Koloni yang tumbuh sebanyak 25 -250 dihitung berdasarkan metode Aerobic Plate Count APC BAM 2001 dengan rumus sebagai berikut. Jumlah koloni cfuml = ℎ Keterangan: n = jumlah cawan d = pengenceran pada cawan pertama 10 -2 5 ml NB Inkubasi 37°C, 24 jam Pengambilan sebanyak 1 ose kultur B. Cereus dalam agar miring Pengenceran 10 -3 Pengenceran 10 -4 Pengenceran 10 -5 Pengenceran 10 -6 Pengenceran Penuangan media NA cair steril Inkubasi pada 37°C, 24 jam dan diamati Gambar 10. Diagram alir persiapan kultur 17 Ekstrak buah takokak Pelarutan dalam DMSO hingga konsentrasi 200 mgml Kultur bakteri Bacillus cereus Pengenceran hingga ~10 5 cfuml Inokulasi 200 µl suspensi bakteri ke 200 ml media NA bersuhu 40-42°C Penuangan 20 ml media berisi bakteri ke dalam cawan dan pembekuan media ± 1 jam dalam refrigerator Pembuatan sumur berdiameter 5 mm Penuangan 60 µl ekstrak ke dalam sumur Inkubasi pada 37°C selama 24 jam Gambar 11. Diagram alir uji aktivitas antibakteri metode difusi sumur

b. Uji difusi sumur Shan et al. 2007 yang dimodifikasi

Ekstrak takokak dilarutkan dalam pelarut organik DMSO hingga diperoleh konsentrasi akhir 200 mgml. Kultur bakteri Bacillus cereus yang telah disegarkan sehari sebelumnya diencerkan hingga ~10 5 CFUmL. Sebanyak 200 μL suspensi bakteri tersebut kemudian diinokulasikan ke dalam 200 ml media NA cair yang bersuhu 40 °C – 42 °C lalu dituang ke dalam cawan dengan volume masing-masing cawan berkisar antara 20-25 ml media. Media tersebut didiamkan selama ± 1 jam agar memadat lalu dibuat sumur berdiameter 5 mm dengan kedalaman ±3-4 mm kemudian sebanyak 60 μL ekstrak dituangkan ke dalam sumur tersebut. Pelarut organik DMSO digunakan sebagai kontrol negatif, dan antibiotik kloramfenikol 25 mgml DMSO digunakan sebagai kontrol positif. Media kemudian diinkubasi selama ± 1 jam dalam refrigerator agar memudahkan ekstrak untuk berdifusi, kemudian kembali diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Aktivitas antibakteri dihitung dengan mengukur diameter zona bening yang dihasilkan di sekitar areal sumur dan dinyatakan sebagai nilai DIZ diameter of inhibition zone. Uji difusi sumur dilakukan sebanyak tiga ulangan masing-masing duplo. 18

c. Uji nilai MIC dengan metode Macrodilution Wiegand et al. 2008 yang dimodifikasi

Nilai Minimum Inhibitory Concentratrion MIC dari ekstrak metanol buah takokak dihasilkan dengan menggunakan metode pengenceran macrodilution. Ekstrak buah takokak terpilih dilarutkan dengan DMSO hingga konsentrasi 600 mgml sebagai larutan stok. Kemudian larutan stok ini diencerkan sesuai dengan konsentrasi yang telah ditentukan seperti yang dapat dilihat pada Tabel 6. Setelah dibuat campuran ekstrak dan NB pada berbagai konsentrasi kemudian masing-masing campuran tersebut diambil sebanyak 1 ml dan ditambahkan 1 ml kultur Bacillus cereus ~10 5 cfuml. Setelah penambahan bakteri dilakukan, secepatnya divorteks dan dihitung jumlah bakteri saat 0 jam dengan metode cawan tuang. Kemudian campuran ekstrak dan bakteri tersebut diinkubasi dalam shaker incubator suhu 37°C selama 24 jam pada kecepatan 150 rpm dan kembali dihitung jumlah bakteri setelah 24 jam dengan metode cawan tuang. Nilai MIC diperoleh dengan membuat kurva hubungan antara persentase penghambatan dan konsentrasi ekstrak yang diuji. Konsentrasi ekstrak terkecil yang menghasilkan persentase penghambatan 90 merupakan nilai MIC Cosentino et al. 1999. Uji nilai MIC dilakukan sebanyak dua ulangan masing-masing duplo. Diagram alir pengujian nilai MIC dapat dilihat pada Gambar 12. Tabel 6. Pembuatan larutan ekstrak untuk uji nilai MIC Tahapan Konsentrasi Ekstrak mgml Sumber V ekstrak yang diambil ml V NB steril ml Konsentrasi Ekstrak Hasil Pengenceran mgml Konsentrasi Ekstrak saat Pengujian mgml 1 600 Stok 1.5 1.5 300 150 2 300 Tahapan 1 0.5 0.5 150 75 3 300 Tahapan 1 1 1.5 120 60 4 120 Tahapan 3 1 1 60 30 5 120 Tahapan 3 0.5 1 40 20 6 60 Tahapan 4 0.5 1 20 10

4. Analisis profil KLT ekstrak buah takokak Gritter et al. 1991

Sebanyak delapan ekstrak hasil dari ekstraksi bertingkat tepung buah takokak dianalisis dengan metode KLT sehingga didapatkan profil KLT dari masing-masing ekstrak. Prosedur yang dilakukan yaitu masing-masing ekstrak ditotolkan pada pelat KLT. Setelah kering, dilakukan elusi dalam bejana yang telah dijenuhkan oleh uap eluen pengembang fase gerak. Bercak hasil elusi diamati di bawah lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm atau menggunakan reagen pewarna bercak seperti vanillin-H 2 SO 4 . Pada analisis profil KLT ini hanya dilihat hasil pemisahan dengan KLT dari ekstrak buah takokak. Pemisahan yang baik adalah yang menunjukkan bercak terbanyak dan terpisah satu sama lain. 19 Jumlah koloni pada t = 0 Jumlah koloni pada t = 24 Ekstrak buah takokak terpilih Ekstrak F1 Pelarutan dengan DMSO Ekstrak STOK 600 mgml Pembuatan seri pengenceran sesuai konsentrasi yang diinginkan Tabel 6 Pengambilan sebanyak 1 ml dari masing-masing seri pengenceran Penambahan kultur bakteri sebanyak 1 ml ~10 5 cfuml Pencampuran Inkubasi dalam shaker incubator 24 jam, 37°C pada 150 rpm Gambar 12. Diagram alir penentuan nilai MIC metode macrodilution 10 -4 10 -5 Pengenceran 10 -6 Pengenceran Penuangan media NA cair steril Inkubasi pada 37°C, 24 jam dan diamati 10 -4 10 -5 Pengenceran 10 -6 Pengenceran Penuangan media NA cair steril Inkubasi pada 37°C, 24 jam dan diamati 20

5. Identifikasi komponen antibakteri dari ekstrak buah takokak terbaik