10 Dalam melakukan proses ekstraksi diperlukan jenis pelarut yang sesuai dengan komponen
yang ingin diekstrak. Hal ini sesuai dengan prinsip dari ekstraksi yakni like dissolve like, dimana pelarut polar akan melarutkan komponen polar dan sebaliknya, komponen non polar akan larut
pada pelarut non polar. Pemilihan pelarut harus disesuaikan dengan komponen bioaktif yang ingin diekstrak Ncube et al. 2008. Pelarut yang baik harus memiliki nilai toksisitas yang
rendah, mudah diuapkan pada suhu rendah, bersifat mengawetkan, dan tidak menyebabkan ekstrak terurai Hughes 2002 dalam Ncube et al. 2008. Pelarut yang paling umum digunakan
dalam penelitian aktivitas antimikroba adalah metanol, etanol, dan air. Pada beberapa tanaman obat, komponen semipolar seperti asam fenolat, flavonoid, dan
alkaloid telah berhasil diekstrak dengan pelarut metanol atau air Moco et al. 2007. Beberapa peneliti menggunakan kombinasi pelarut dengan polaritas yang berbeda untuk menghasilkan
proses ekstraksi yang terbaik Cowan 1999. Selain penggunaan campuran pelarut, salah satu teknik ekstraksi yang juga umum digunakan adalah ekstraksi bertingkat menggunakan pelarut
dengan kepolaran yang meningkat, mulai dari pelarut yang non-polar hingga pelarut polar. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan komponen dengan kisaran yang lebih luas. Penelitian
Sivapriya et al. 2011 menunjukkan bahwa aktivitas antibakteri tertinggi dari kulit buah takokak dihasilkan oleh ekstrak dengan pelarut campuran etanol dan air.
G. KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS KLT
Kromatografi lapis tipis merupakan teknik kromatografi yang banyak digunakan sebagai instrumen analisis yang cepat dan mudah dilakukan. KLT dikenal sebagai metode yang cepat
untuk mendeteksi suatu senyawa Cserhati dan Forgacs 1999. KLT lebih efisien untuk digunakan karena resiko yang ada lebih sedikit dibandingkan kromatografi cair
– tekanan tinggi atau kromatografi gas. Resiko tersebut meliputi prosedur yang lebih sederhana dan mudah serta
pemilihan pelarut yang lebih beragam sehingga biaya dalam penggunaan teknik KLT ini relatif lebih murah.
Prinsip KLT ini sangat sederhana, campuran zat terlarut dipisahkan dengan membuat spot kecil pada fase diam kemudian diinkubasi dalam chamber tertutup yang berisi fase gerak.
Interaksi antara molekul zat terlarut dengan fase diam dan fase bergerak akan menghasilkan perbedaan mobilitas dan pemisahan pada KLT. Fase gerak akan membawa zat terlarut yang ada
dalam campuran senyawa tersebut bergerak pada jarak tertentu Cserhati dan Forgacs 1999. Zat terlarut ini akan membentuk bercak yang berwarna bila divisualisasi dengan UV dan reagen
tertentu. Ilustrasi pemisahan senyawa dengan KLT dapat dilihat pada Gambar 5.
Salah satu teknik sederhana untuk mengidentifikasi komponen dalam pelat KLT ialah dengan penyemprotan reagen penampak bercak Harborne 1973. Selain itu, apabila pelat KLT yang
Pelat KLT silika
Fase gerak memisahkan senyawa
menjadi fraksi dan dihasilkan
bercakspot
Gambar 5. Ilustrasi pemisahan senyawa dengan KLT Anonim
3
2012
11 digunakan telah mengandung indikator fluoresensi maka dapat dilakukan penyinaran dengan sinar
UV pada panjang gelombang tertentu sehingga komponen yang terdapat dalam pelat akan bersinar. Pada umumnya, panjang gelombang yang digunakan dalam penyinaran sinar UV adalah
panjang gelombang pendek, yakni 254 nm dan panjang gelombang 366 nm. Senyawa yang terpisah dalam pelat KLT akan memiliki nilai Rf yang bersifat spesifik. Nilai Rf merupakan jarak
yang ditempuh oleh suatu senyawa relatif terhadap jarak yang ditempuh oleh garis depan fase gerak Gambar 6. Nilai Rf ini berada diantara nilai 0 hingga 1 Gritter et al. 1991. Ilustrasi
penentuan nilai Rf dapat dilihat pada Gambar 6.
Aplikasi KLT untuk menganalisis pemisahan senyawa antibakteri telah ditunjukkan oleh beberapa peneliti Kumar et al. 2010; Haswirna 2006. Penggunaan teknik KLT dalam
menganalisis aktivitas antibakteri dari ekstrak yang difraksinasi juga telah dilakukan oleh Nwodo et al. 2010 pada ekstrak tanaman asam jawa Tamarindus indica. Identifikasi beberapa senyawa
dalam buah takokak menggunakan pelat KLT juga telah dilakukan oleh Arif dan Fareed 2011 yang menunjukkan adanya komponen rutin dan digoxin. Hal ini menunjukkan bahwa teknik KLT
dapat diaplikasikan untuk mengidentifikasi komponen antibakteri dari suatu ekstrak tanaman.
a b
� = =
� � ℎ
� � �
� ℎ �
Gambar 6. Ilustrasi penentuan nilai Rf
12
III. BAHAN DAN METODE
A. BAHAN DAN ALAT
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah bahan untuk tahap ekstraksi, uji aktivitas antibakteri, uji komponen dan identifikasi dengan KLT. Bahan-bahan yang digunakan
untuk ekstraksi adalah metanol dan aquades. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri antara lain kultur Bacillus cereus, media nutrient agar, nutrient broth, DMSO, dan
kloramfenikol. Pada pengujian komponen dan identifikasi dengan KLT bahan-bahan yang digunakan berbagai jenis pelarut seperti kloroform, etil asetat, etanol, asam asetat, heksan, dietil
eter, n-butanol. Alat yang digunakan untuk ekstraksi adalah loyang alumunium, timbangan kasar, freeze dryer, blender kering, saringan 30 mesh, plastik double seal serta peralatan gelas kimia
seperti labu takar, gelas ukur, pipet Mohr, pipet tetes, pipet mikro, neraca analitik, spatula, dan gelas pengaduk, desikator tabung reaksi, tabung vial, gelas piala, spektrofotometer, dan rotary
vacuum evaporator. Alat-alat yang digunakan untuk uji aktivitas antibakteri adalah cawan petri, inkubator, pipet Mohr, pipet mikro, tip, bunsen, korek api, kapas, tabung reaksi, plastik, dan
autoklaf. Alat untuk uji komponen dan identifikasi adalah pelat untuk KLT, jar, pinset, pipet kapiler, penggaris, dan lampu UV.
B. METODE PENELITIAN
Metode penelitian identifikasi komponen antibakteri buah takokak ini terdiri dari lima tahapan utama. Tahap pertama adalah persiapan sampel, selanjutnya tahap kedua adalah
ekstraksi bertingkat yang akan menghasilkan delapan ekstrak buah takokak. Sebanyak delapan ekstrak ini kemudian diuji aktivitas antibakteri dan uji pemisahan dengan KLT. Tahap terakhir
adalah analisis data dan identifikasi komponen antibakteri dari ekstrak buah takokak yang menunjukkan aktivitas antibakteri tertinggi dan pemisahan KLT yang baik. Diagram alir tahapan
penelitian dapat dilihat pada Gambar 7.
Sebanyak 8 ekstrak dengan polaritas pelarut yang berbeda
Pengujian komponen dengan KLT Pengujian aktivitas antibakteri
Ekstraksi bertingkat
Analisis data dan identifikasi ekstrak terbaik Persiapan sampel
Gambar 7. Diagram alir tahapan penelitian
