16
3. Analisis aktivitas antibakteri
a. Persiapan kultur Bacillus cereus
Persiapan kultur dilakukan dengan terlebih dahulu menguji keseragaman kultur Bacillus cereus dengan pewarnaan Gram. Pewarnaan Gram dilakukan di atas kaca
preparat. Kultur disebar di atas kaca sehingga terbentuk lapisan tipis kemudian difiksasi dan ditambahkan pewarna ungu kristal didiamkan selama 2 menit dan dibilas. Selanjutnya
ditambahkan larutan lugol didiamkan selama 1 menit dan kembali dibilas dengan alkohol, terakhir ditambahkan pewarna merah safranin, dan dikeringkan. Morfologi bakteri dilihat
menggunakan mikroskop hingga pembesaran 1000x. Sel bakteri dengan morfologi berwarna ungu merupakan bakteri Gram-positif, sedangkan sel bakteri dengan morfologi
berwarna merah merupakan bakteri Gram-negatif Madigan et al. 2003. Selanjutnya dilakukan perhitungan total kultur bakteri uji menggunakan metode
Aerobic Plate Count APC untuk mengetahui jumlah total bakteri awal sehingga dapat diketahui jumlah pengenceran yang diperlukan agar jumlah bakteri saat pengujian lebih
seragam. Tahap persiapan kultur bakteri dapat dilihat pada Gambar 10. Sebanyak 1 ose bakteri Bacillus cereus diinokulasikan pada 5 ml NB steril kemudian diinkubasikan pada
suhu 37°C selama 24 jam. Kultur bakteri ini yang selanjutnya digunakan dalam pengujian. Media NB yang telah berisi bakteri kemudian diencerkan pada seri
pengenceran 10
2
-10
6
dan ditumbuhkan pada media NA serta diinkubasi selama 24 jam suhu 37°C. Koloni yang tumbuh sebanyak 25 -250 dihitung berdasarkan metode Aerobic
Plate Count APC BAM 2001 dengan rumus sebagai berikut. Jumlah koloni cfuml =
ℎ Keterangan: n = jumlah cawan
d = pengenceran pada cawan pertama
10
-2
5 ml NB Inkubasi 37°C,
24 jam
Pengambilan sebanyak 1 ose kultur B. Cereus dalam agar miring
Pengenceran
10
-3
Pengenceran
10
-4
Pengenceran
10
-5
Pengenceran
10
-6
Pengenceran
Penuangan media NA cair steril
Inkubasi pada 37°C, 24 jam dan diamati
Gambar 10. Diagram alir persiapan kultur
17
Ekstrak buah takokak
Pelarutan dalam DMSO hingga
konsentrasi 200 mgml
Kultur bakteri Bacillus cereus
Pengenceran hingga ~10
5
cfuml Inokulasi 200 µl suspensi bakteri ke
200 ml media NA bersuhu 40-42°C
Penuangan 20 ml media berisi bakteri ke dalam cawan dan pembekuan media ± 1 jam dalam refrigerator
Pembuatan sumur berdiameter 5 mm
Penuangan 60 µl ekstrak ke dalam sumur
Inkubasi pada 37°C selama 24 jam Gambar 11. Diagram alir uji aktivitas antibakteri metode difusi sumur
b. Uji difusi sumur Shan et al. 2007 yang dimodifikasi
Kategori