36
y = 0.1239x + 75.449 R² = 0.982
82 84
86 88
90 92
94 96
50 100
150 200
P e
r se
n tas
e
p e
n gh
am b
atan
Konsentrasi ekstrak mgml
Hasil penelitian menunjukkan setelah penambahan ekstrak dengan konsentrasi yang tinggi yakni 60 mgml, 75 mgml dan 150 mgml terjadi penurunan jumlah bakteri yang
pada pengamatan saat 0 jam. Semakin tinggi konsentrasi ekstrak tentunya semakin banyak jumlah senyawa metabolit yang terkandung dalam ekstrak tersebut. Senyawa metabolit
inilah yang kemungkinan langsung bereaksi dengan sel bakteri menyebabkan kerusakan membran secara langsung atau terbentuknya agregasi sel bakteri seperti yang telah
dijelaskan sebelumnya sehingga pada saat pengamatan 0 jam terlihat penurunan jumlah bakteri hingga satu log. Oleh karena itu, dalam perhitungan nilai MIC pada penelitian ini,
penurunan jumlah bakteri setelah 24 jam dihitung dari jumlah sel bakteri kontrol negatif saat 0 jam yang diasumsikan sebagai jumlah bakteri awal yang terdapat dalam campuran
ekstrak buah takokak. Berdasarkan perhitungan tersebut, penghambatan bakteri oleh ekstrak F1 mulai
terlihat pada konsentrasi 60 mgml dengan nilai persentase penghambatan sebesar 83.61 kemudian persentase penghambatan ini meningkat menjadi 83.87 pada konsentrasi 75
mgml. Pada konsentrasi 150 mgml nilai persentase penghambatan yang didapatkan lebih dari 90 yaitu sebesar 94.18. Nilai MIC adalah konsentrasi terkecil yang menunjukkan
adanya aktivitas penghambatan 90 Cosentino et al. 1999 oleh karena itu pada penelitian ini nilai MIC ekstrak F1 sebesar 150 mgml. Penentuan nilai MIC juga dapat
ditentukan dengan pembuatan kurva.
Hasil pengujian nilai MIC ekstrak F1 pada konsentrasi 60 mgml, 75 mgml, dan 150 mgml ini dapat dibuat kurva hubungan antara persentase penghambatan yang dihasilkan
dan konsentrasi dari ekstrak tersebut sehingga akan didapatkan suatu persamaan untuk menduga nilai MIC yang sesungguhnya Gambar 19. Kurva hubungan ini menghasilkan
persamaan y = 0.1239 x + 75.449 dengan x adalah konsentrasi ekstrak dalam mgml dan y
adalah persentase penghambatan dalam satuan . Dari persamaan tersebut kita dapat menentukan konsentrasi ekstrak F1 yang memiliki penghambatan tepat 90 sehingga
didapatkan nilai MIC ekstrak F1 sebesar 117.44 mgml.
D. PROFIL KLT EKSTRAK BUAH TAKOKAK
A nalisis profil KLT ekstrak buah takokak dilakukan
menggunakan pelat KLT silica gel F254 dari Merck. Dalam analisis profil KLT ekstrak buah takokak ini digunakan beberapa
kombinasi pelarut sebagai fase gerak sehingga dapat diperoleh pemisahan senyawa yang terbaik. Pemisahan senyawa yang baik dalam KLT memiliki ciri yaitu terbentuk bercak yang banyak dan
Gambar 19. Kurva penghambatan ekstrak F1 terhadap bakteri Bacillus cereus 117.44
37 terpisah dengan jelas Gritter et al., 1991. Analisis KLT dilakukan dalam dua tahap seperti pada
uji aktivitas antibakteri difusi sumur. Pada tahap pertama seluruh ektrak hasil ekstraksi bertingkat dianalisis menggunakan pelat KLT dengan fase gerak campuran antara metanol dan
kloroform seperti yang terlihat pada Gambar 20. Hasil pemisahan dengan KLT pada fase gerak tertentu akan memisahkan komponen yang terkandung dalam ekstrak dan terlihat sebagai bercak
pada pelat KLT. Visualisasi bercak dilakukan dengan penyinaran UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Selain penyinaran dengan UV juga digunakan reagen vanilin-H
2
SO
4
sebagai
penampak bercak. Hasil pemisahan KLT pada tahap pertama dapat dilihat pada Gambar 20.
Pada Gambar 20 terlihat bahwa pada fase gerak kloroform:metabol 6:5 dihasilkan bercak yang lebih banyak dan pemisahan yang lebih baik dibandingkan pada fase gerak lainnya. Hasil
visualisasi pada panjang gelombang 254 nm, kromatogram menunjukkan bercak berwarna hitam dan abu-abu. Dalam Harborne 1973 disebutkan bahwa komponen fenolik akan berwarna hitam
apabila dilihat pada panjang gelombang 254 nm. Pada panjang gelombang 366 nm ketiga fase gerak menunjukkan bahwa terdapat empat bercak utama dengan warna biru muda, biru, ungu,
dan merah. Bercak berwarna biru dan ungu yang terlihat diduga termasuk ke dalam golongan flavonoid Marston dan Hostettmann 2006. Bercak berwarna merah diduga merupakan senyawa
klorofil, hal ini diperkuat dengan penampakan pada sinar tampak, bercak tersebut berwarna hijau Harborne 1973. Keempat bercak ini terlihat pada ekstrak buah takokak F1 hingga F5 namun
semakin ke kanan yang artinya semakin polar ekstrak, bercak ini semakin memudar bahkan tidak nampak. Hal ini menunjukkan bahwa komponen aktif dalam buah takokak banyak terdapat pada
ekstrak F1 hingga F5. Reagen vanilin-H
2
SO
4
menghasilkan warna kuning dan hijau pada hasil pemisahan dengan KLT. Reagen vanilin-H
2
SO
4
umumnya digunakan untuk identifikasi senyawa fenol sederhana dan asam fenolat Harborne 1973. Senyawa fenol golongan katekin dan
proantosianidin akan nampak berwarna merah atau merah-lembayung setelah penyemprotan dan pemasanan Markham 1988. Hasil penyemprotan dengan reagen vanilin-H
2
SO
4
tidak memberikan hasil yang diharapkan sehingga pada pengujian selanjutnya reagen ini tidak
digunakan. Pereaksi vanilin bereaksi dengan semua flavonoid yang memiliki pola oksidasi lingkar-A florogusinol dan lingkar-C jenuh yang umumnya tidak nampak pada penyinaran sinar
UV Markham 1988. Mungkin komponen metabolit tersebut berada dalam jumlah sedikit dalam ekstrak buah takokak sehingga ketika digunakan vanillin, senyawa tersebut tidak nampak. Oleh
karena itu, pada penelitian selanjutnya reagen vanillin tidak digunakan. Ekstrak F6 hingga F8 tidak menunjukkan bercak berwarna ketika disinari dengan sinar UV
dan penyemprotan dengan vanilin-H
2
SO
4
namun hal ini belum dapat memastikan bahwa pada ekstrak tersebut tidak terdapat komponen metabolit. Pemisahan senyawa dengan KLT memiliki
resolusi yang rendah sehingga apabila ekstrak ini dipisahkan dengan teknik kromatografi lain seperti HPLCGC yang resolusinya lebih baik, mungkin akan lebih banyak senyawa lain yang
dapat dideteksi Khatib dan Yuliana 2010. Selain itu, komponen metabolit yang menunjukkan bercak berwarna pada penyinaran UV merupakan golongan yang memiliki struktur aromatik
yang dapat berkromofor dan menyerap panjang gelombang pada absorbansi tertentu Fernand 2003.
38
Penyinaran UV 366 nm
Penyemprotan dengan vanillin-H
2
SO
4
a b
c
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
Penyinaran UV 254 nm
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8 F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
Gambar 20. Kromatogram dan visualisasi hasil pemisahan KLT ekstrak buah takokak pada fase gerak kloroform:metanol dengan perbandingan:
a 7 : 3 b 5 : 5
c 6 : 5
39
Penyinaran UV 254 nm Penyinaran UV 366 nm
Berdasarkan hasil pada tahap pertama tersebut, maka pada tahap kedua dilakukan analisis KLT kembali namun analisis dilakukan hanya pada ekstrak F1 hingga F5 karena pada tahap
pertama hanya kelima ekstrak tersebut yang menghasilkan bercak setelah visualisasi dengan penyinaran UV dan reagen vanilin-H
2
SO
4
. Pada tahap kedua ini fase gerak yang digunakan adalah campuran kloroform dan metanol dengan perbandingan 6:5 yang merupakan fase gerak
terbaik pada analisis KLT tahap pertama. Pada tahap kedua ini sebanyak 200 mg masing-masing ekstrak dilarutkan dengan 1 ml DMSO kemudian sebanyak 1 µl ekstrak ditotolkan pada pelat
KLT. Konsentrasi ini disesuaikan dengan konsentrasi saat pengujian aktivitas antibakteri. Hasil pemisahan dan visualisasi bercak ekstrak F1 hingga F5 dapat dilihat pada Gambar 21.
.
Secara umum, bercak yang dihasilkan ekstrak F1 hingga F5 tidak berbeda, perbedaan terletak pada ukuran bercak saja. Ekstrak F1 hingga F5 diekstrak dengan campuran pelarut
metanol dan air pada beberapa kombinasi namun selang perbandingan metanol dan air yang digunakan tidak jauh berbeda. Hal ini yang mungkin menyebabkan komponen metabolit yang
terekstrak antara ekstrak F1 dengan ekstrak lainnya mirip bahkan sama. Selain itu, metanol dan air memiliki tingkat kepolaran yang tidak jauh berbeda sehingga kemungkinan komponen
Gambar 21. Kromatogram hasil pemisahan KLT ekstrak buah takokak hasil terpilih konsentrasi 200 mg berat keringml, sebanyak 1µl dengan fase gerak
kloroform:metanol 6 : 5
F1 F2 F3 F4 F5 F1 F2 F3 F4 F5
40 metabolit yang terekstrak pun hampir sama Tiwari et al. 2011. Ekstrak F1 menunjukkan ukuran
bercak yang lebih pekat dan lebih besar dibanding ekstrak lainnya. Hal ini dapat mengindikasikan bahwa ekstrak F1 mengandung komponen metabolit yang lebih banyak
dibanding ekstrak lainnya. Ekstrak F1 merupakan ekstrak hasil proses ekstraksi yang pertama sehingga komponen metabolit yang terekstrak lebih banyak karena komponen metabolit dalam
tepung buah takokak masih lengkap. Pada proses ekstraksi yang kedua, komponen metabolit dalam tepung buah takokak telah berkurang karena telah terekstrak pada tahap pertama sehingga
ekstrak F2 mengandung komponen yang lebih sedikit dari ekstrak F1, begitu seterusnya Hasil pemisahan pada tahap kedua ini tidak jauh berbeda dengan pemisahan pada tahap
pertama. Pada panjang gelombang 366 nm kembali terlihat bercak berwarna biru muda, biru, ungu, dan merah namun bercak yang dihasilkan lebih besar dibanding dengan bercak pada tahap
pertama. Perbedaan yang cukup signifikan terlihat pada bercak berwarna biru pada panjang gelombang 366 nm dan warna hitam pada panjang gelombang 254 nm. Hal ini dapat disebabkan
oleh konsentrasi yang digunakan yaitu 200 mgml terlalu besar sehingga pemisahan tidak terlalu baik. Pada analisis tahap kedua ekstrak F1 juga menunjukkan ukuran bercak yang lebih besar
dibanding ekstrak lainnya. Hasil ini semakin menguatkan dugaan bahwa pada penelitian ini ekstrak F1 mengandung komponen aktif dari buah takokak yang lebih banyak dibanding ekstrak
lainnya. Hasil pemisahan dengan KLT sebelumnya diketahui bahwa ekstrak F1 mengandung komponen metabolit yang lebih banyak dibanding ekstrak lainnya oleh karena itu ekstrak F1
kemudian diuji profil KLT-nya menggunakan berbagai jenis pelarut. Profil pemisahan KLT ini dapat digunakan sebagai gambaran umum mengenai komponen metabolit yang mungkin
terkandung dalam buah takokak. Kromatogram hasil pemisahan KLT ekstrak F1 dapat dilihat pada Gambar 22. Pemisahan
ekstrak F1 dilakukan menggunakan berbagai kombinasi pelarut sebagai fase gerak.
Gambar 22a. Kromatogram hasil pemisahan KLT ekstrak F1 pada berbagai fase gerak, a Kloroform : metanol 6 : 5
b Butanol : asam asetat : air c Kloroform : asam asetat 9 : 1
d Kloroform : etil asetat 7 : 3 e Heksan : dietileter 7 : 3
f Air a b
c d
e f
41
Penyinaran UV 254 nm
a b c
d e
f
Penyinaran UV 366 nm
Fase gerak kloroform:metanol 6:5 merupakan fase gerak yang menghasilkan pemisahan terbaik pada KLT tahap pertama, oleh karena itu fase gerak ini kembali digunakan. Beberapa fase gerak
lainnya diperoleh dengan melihat referensi terutama dalam Harborne 1973 yang memuat tentang pemisahan komponen metabolit menggunakan KLT. Pada analisis profil KLT ekstrak
buah takokak hasil ekstraksi bertingkat ini dugaan mengenai komponen metabolit yang berperan sebagai antibakteri belum dapat dipastikan secara jelas. Komponen metabolit ini dapat diketahui
dengan melakukan analisis data dan tahapan identifikasi. Identifikasi komponen metabolit dapat dilakukan menggunakan KLT melalui perbandingan nilai Rf dan sifat spektral dari bercak yang
dihasilkan Kumar et al. 2010; Haswirna 2006. Gambar 22b. Kromatogram hasil visualisasi pemisahan KLT ekstrak F1 pada berbagai fase gerak,
a Kloroform : metanol 6 : 5 b Butanol : asam asetat : air
c Kloroform : asam asetat 9 : 1 d Kloroform : etil asetat 7 : 3
e Heksan : dietileter 7 : 3 f Air
42
E. IDENTIFIKASI KOMPONEN ANTIBAKTERI EKSTRAK TERBAIK
