BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan Pusat Penelitian Lingkungan Hidup, Institut Pertanian Bogor PPLH IPB dari bulan Oktober
sampai bulan Desember 2011.
3.2 Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan dalam pembuatan media yaitu gelas piala, gelas ukur biasa, pipet volumetrik, neraca analitik, pH meter, panci, pengaduk, autoklaf,
karet gelang, timbangan analitik, labu Erlenmeyer, labu takar, botol kultur, dan plastik, sedangkan untuk kegiatan sterilisasi dan penanaman alat-alat yang
digunakan yaitu sendok spatula, petridish, scalpel, tissue, cawan petri, pisau, pinset, lampu Bunsen, laminar air flow cabinet, timer, aluminium foil, plastik
wrap, dan handsprayer serta alat tulis dan kamera digital untuk kegiatan pengamatan.
Bahan-bahan yang digunakan dalam pembuatan media yaitu larutan stok, media MS Murashige dan Skoog, agar-agar, gula pasir, air steril, BAP 6-benzyl
amino purine, sedangkan bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan sterilisasi dan penanaman yaitu alkohol 70, deterjen, air steril, HgCl
2
, clorox, antiseptik betadine, eksplan jelutung Dyera costulata berupa biji, dan larutan colchicine.
Biji jelutung berasal dari PT Xylo Indah Pratama yang didatangkan dari pulau Sumatera yang sudah disimpan selama 6 bulan.
3.3 Metode Pengumpulan Data
Jenis data yang dikumpulkan pada penelitian ini adalah data primer. Data primer dilakukan dan diamati secara langsung di laboratorium terdiri dari tinggi
eksplan, jumlah dan panjang akar, jumlah daun dan ruas baru eksplan.
3.4. Batasan Penelitian
Pengambilan data primer hanya dilakukan pada tinggi eksplan, jumlah dan panjang akar, jumlah daun, dan ruas baru eksplan.
3.5 Prosedur Kerja 3.5.1 Sterilisasi alat dan media kultur
Alat-alat yang digunakan dalam kegiatan kultur jaringan seperti botol kultur, pinset, scalpel, cawan petri, pengaduk, pipet, gelas piala, labu takar dicuci
bersih menggunakan detergen. Kemudian alat-alat yang digunakan dalam penanaman disterilisasi dengan membungkus alat-alat tersebut menggunakan
kertas koran dan selanjutnya semua alat-alat tersebut dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121ºC - 126ºC dengan tekanan 1,5 atm selama 60 menit.
Sedangkan untuk media yang telah dimasukkan ke dalam botol kultur lalu dimasukkan ke dalam autoklaf pada suhu 121ºC - 125ºC dengan tekanan 1,5 atm
selama 20 menit. Untuk sterilisasi air yang digunakan dalam proses sterilisasi eksplan dan penanaman disterilisasi seperti cara mensterilisasi media.
3.5.2 Sterilisasi lingkungan kerja
Pembersihan laboratorium dilakukan setiap hari terutama untuk penyeleksian botol kultur yang terkontaminasi. Pengepelan dan penyemprotan rak
kultur dengan alkohol juga dilakukan secara berkala. Pembersihan tempat kerja laminar air flow cabinet dapat dilakukan dengan mengelap permukaan atau
meja kerja dan dinding porselin dengan menggunakan kapas atau tisu yang telah disemprot alkohol 70. Selama tidak digunakan, lampu ultra violet yang ada pada
laminar air flow cabinet dinyalakan dan ketika digunakan harus dimatikan karena jika tidak dimatikan akan membahayakan kesehatan pengguna laminar air flow
cabinet Hendaryono Wijayani 1994. Lalu sebelum dan selama pemakaian, blower atau peniup udara dalam laminar air flow cabinet harus dinyalakan untuk
menghindari adanya kontaminan yang masuk ke dalam botol kultur ketika penanaman. Kemudian sebelum melakukan pekerjaan maka dilakukan
penyemprotan dengan alkohol 70 terhadap kedua telapak tangan, botol kultur, ataupun alat-alat yang akan digunakan dalam penanaman.
3.5.3 Sterilisasi bahan eksplan
Biji jelutung yang dikultur diberi perlakuan sterilisasi yang meliputi sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet dan sterilisasi di dalam laminar
air flow cabinet. Adapun tahapan sterilisasi eksplan di luar laminar air flow cabinet meliputi:
1. Pembersihan permukaan biji jelutung dengan cara dikerok menggunakan pisau
2. Pembersihan biji jelutung dengan alkohol 70 dengan cara digosok
menggunakan kapas yang telah dibasahi alkohol 3.
Pencucian dengan detergen 10 menit 4.
Pembilasan dengan menggunakan air bersih Sedangkan untuk tahapan sterilisasi eksplan di dalam laminar air flow
cabinet meliputi: 1.
Pencucian dengan menggunakan HgCl
2
10 selama 7 menit 2.
Pencucian dengan menggunakan clorox 20 selama 7 menit 3.
Pencucian dengan menggunakan clorox 10 selama 7 menit 4.
Pembilasan dengan menggunakan air steril sebanyak 2 kali selama 10 menit
3.5.4 Pembuatan media 3.5.4.1 Pembuatan larutan stok
Pembuatan larutan stok dilakukan secara terpisah sesuai dengan pengelompokkannya yaitu larutan stok makro, stok mikro, stok fe-EDTA, stok
vitamin, dan stok hormon BAP. Adapun rincian komposisinya yaitu larutan stok makro terdiri dari KNO
3
, NH
4
NO
3
, CaCl
2
.2H
2
O, MgSO
4
. 7H
2
O, dan KH
2
PO
4
masing-masing dibuat secara terpisah. Larutan stok mikro terdiri dari campuran MNSO
4
. H
2
O, ZnsSO
4
. 7H
2
O, H
3
BO
3
, KI, NA
2
MoO
4
, 2H
2
O, CoCl. 6H
2
O, 4CuSO
4
. 5H
2
O. Larutan stok fe-EDTa terdiri dari campuran senyawa dari Thiamin HCl, Nicotinic Acid, Pyridoxin HCl, dan Glycin. Serta larutan stok
hormon BAP. Unsur hara yang telah ditimbang beratnya sesuai dengan yang telah ditentukan kemudian dilarutkan dengan 1 liter aquades. Setelah larutan stok
selesai dibuat selanjutnya disimpan di lemari es.
3.5.4.2 Pembuatan media Murashige Skoog MS dengan larutan BAP
Pembuatan media dimulai dengan pembuatan larutan stok MS dan hormon BAP yang telah dipersiapkan sebelumnya. Untuk pelaksanaan pembuatan media
yaitu sebagai berikut: 1.
Menyiapkan 500 ml air aquadest dalam panci 2.
Memasukkan gula pasir sebanyak 30 gram 3.
Memipet dan memasukkan larutan A, B, C, D, E, F, dan myo inositol masing- masing 5 ml, vitamin sebanyak 4 ml, dan hormon BAP sebanyak 0,5 ml.
4. Menambahkan air aquadest hingga volume menjadi tepat 1000 ml.
5. Mengukur pH larutan yaitu 4, jika terlalu asam tambahkan NaOH dan jika
terlalu basah tambahkan HCl. 6.
Memasukkan 6 gram agar-agar ke dalam larutan tersebut. 7.
Memasak larutan media dalam panci hingga mendidih. 8.
Menuangkan media ke dalam botol kultur yang telah diisi kapas. 9.
Menutup botol dengan plastik dan karet. 10.
Mensterilkan media di dalam autoklaf pada suhu 121ºC-126ºC dan pada tekanan 1,5 atm selama 20 menit.
11. Memasukkan media-media yang sudah steril ke dalam plastik dan simpan di
lemari penyimpan media.
3.5.4.3 Pembuatan media perlakuan
Pembuatan media perlakuan diawali dengan proses yang sama ketika membuat media kontrol MS0+BAP0,5. Akan tetapi untuk media perlakuan pada
larutan MS0+BAP0,5 ditambahkan colchicine sesuai dengan perlakuan yakni sebesar 0 mll kontrol, 0,5 mll, 1,0 mll, 1,5 mll, dan 2,0 mll. Penambahan
colchicine ini dilakukan setelah larutan MS0+BAP0,5 diencerkan dengan air aquadest hingga 1 liter dan dibagi ke dalam 5 bagian masing-masing sebanyak
200 ml. Setelah masing-masing larutan selesai dibuat, larutan diukur pHnya
dengan menggunakan pH meter. Pada umumnya teknik in vitro menggunakan pH media sebesar 5,6 - 5,8. Akan tetapi untuk perlakuan kultur biji jelutung ini
menggunakan pH 4, sehingga yang awalnya pH media kisaran 6 diturunkan
dengan menambahkan HCl hingga pH tepat menunjukkan 4. Selanjutnya larutan media ditambahkan dengan agar-agar sebanyak 1,5 gr 200 ml untuk tiap
perlakuan dan dimasak hingga mendidih. Setelah itu larutan dituang ke dalam botol-botol kultur yang sudah berisi kapas sebanyak ±10 ml. Lalu botol ditutup
dengan rapat menggunakan plastik dan karet serta diberi label. Langkah selanjutnya yaitu melakukan sterilisasi media tersebut dalam autoclave pada suhu
121ºC-126 ºC pada tekanan 1,5 atm selama 20 menit.
3.5.5 Penanaman
Penanaman eksplan biji jelutung dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. Setelah dilakukan sterilisasi eksplan kemudian eksplan dimasukkan ke
dalam petridish dan lapisan tipis yang menutupi biji jelutung dilepaskan menggunakan pisau yang sudah disterilkan. Lalu biji jelutung ditanam ke dalam
media kultur. Setelah selesai penanaman botol kultur ditutup kembali dengan plastik dan karet ditambah dengan alumunium foil dan dibungkus lalu disimpan di
dalam ruang kultur yang suhu dan cahayanya telah diatur. Cahaya yang digunakan pada pagi hingga sore hari yaitu dari pantulan cahaya matahari, sedangkan pada
sore hingga malam hari menggunakan cahaya lampu.
3.5.6 Pengamatan rancangan percobaan
Pengamatan dilakukan kurang lebih 11 minggu setelah tanam dan pengambilan data dilakukan setiap satu minggu sekali. Selama 11 minggu ini
pengamatan dibagi ke dalam dua kategori. Pengamatan kategori pertama dilakukan pada awal penanaman hingga eksplan sudah tumbuh dan masih berada
di media yang mengandung colchicine untuk yang perlakuan. Pengamatan ini dilakukan selama 5 minggu. Lalu pengamatan kategori kedua dilakukan ketika
eksplan untuk yang perlakuan yang semula tumbuh di media dengan campuran colchicine dipindahkan ke media pemulih tanpa colchicine. Pengamatan ini
dilakukan selama 6 minggu. Adapun parameter yang diamati adalah:
1. Jumlah eksplan yang hidup
Penghitungan dilakukan dengan cara megnhitung jumlah eksplan yang masih bertahan hidup yang ditandai dengan eksplan yang masih berwarna seperti
awal penanaman. 2.
Jumlah eksplan yang mati Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah eksplan yang mati
yang ditandai dengan eksplan yang mulai menghitam. 3.
Tinggi eksplan Pengukuran dilakukan dengan cara mengukur dari pangkal eksplan sampai
titik tumbuh tertinggi. 4.
Jumlah akar yang tumbuh Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah akar yang tumbuh
pada eksplan. 5.
Panjang akar yang tumbuh Pengukuran dilakukan dengan cara mengukur dari pangkal akar eksplan
sampai ujung akar. 6.
Jumlah daun yang tumbuh Penghitungan dilakukan dengan cara menghitung jumlah daun yang tumbuh.
7. Jumlah ruas baru eksplan
Penghitungan dilakukan dengan cara mengamati jumlah ruas baru pada eksplan yang sudah tumbuh.
3.6 Metode Analisis Data
Rancangan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap RAL dengan satu faktor yaitu konsentrasi colchicine. Konsentrasi yang
digunakan adalah 0 mgl kontrol, 0,5 mgl, 1 mgl, 1,5 mgl, dan 2 mgl. Penelitian dilakukan dengan 5 perlakuan dengan masing-masing perlakuan
diulang sebanyak 25 kali. Model umum rancangan yang digunakan adalah sebagai berikut:
Yij = µ + τi + εij : i = 1, 2, 3, 4, 5 j = 1, 2, 3, …. , 25
Yij = hasil pengamatan terhadap eksplan jelutung pada konsentrasi colchicine ke-i dan ulangan ke-j.
µ = nilai tengah umum rata-rata populasi Τi = pengaruh konsentrasi colchicine ke-i.
ij = pengaruh galat percobaan pada eksplan jelutung ke-j yang memperoleh perlakuan konsentrasi colchicine ke-i.
Hipotesis dalam uji F: Ho = Perlakuan tidak berpengaruh terhadap pertumbuhan tinggi, jumlah akar,
panjang akar, jumlah daun, dan ruas baru eksplan. Hi = Perlakuan berpengaruh terhadap pertumbuhan tinggi, jumlah daun, dan ruas
baru eksplan. Pengambilan keputusan uji F:
F hitung F tabel maka tolak Ho. F hitung = F tabel.
F hitung F tabel maka terima Ho. Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis dengan
menggunakan ANOVA. Apabila ada perbedaan nyata diantara perlakuan maka dilakukan uji lanjut dengan menggunakan uji Duncan. Program yang digunakan
ialah SPSS 16.0.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Persentase Hidup Eksplan
Jumlah eksplan jelutung yang ditanam sebanyak 125 eksplan yang telah diinisiasi pada media kultur dan diamati selama 11 minggu setelah masa tanam
MST. Dari hasil pengamatan diperoleh 27 eksplan yang masih tetap bertahan dari 125 eksplan yang ditanam, sedangkan 98 eksplan mengalami kematian
permanen yang ditandai dengan menghitamnya benih secara perlahan-lahan. Banyaknya jumlah eksplan yang mati ini kemungkinan besar dikarenakan oleh
benih yang digunakan bisa dikatakan kurang baik mengingat kondisinya yang sudah 3 bulan dalam masa penyimpanan sehingga kondisinya kurang baik untuk
dijadikan eksplan. Hal ini menjadi salah satu kendala yang ada ketika hendak melakukan budidaya jelutung, karena pada umumnya daya tumbuh benih akan
berkurang dengan bertambahnya waktu Tjitrosoepomo 2007. Tujuan utama dari penyimpanan benih tanaman bernilai ekonomis ialah
mengawetkan cadangan bahan tanam dari satu musim ke musim berikutnya Justice Bass 2002. Akan tetapi hal ini tidak bisa menjadi jaminan agar
kualitas benih tetap baik setelah melalui proses penyimpanan tersebut. Begitu juga yang terjadi pada benih jelutung ini. Viabilitas benih dapat diperpanjang apabila
benih disimpan pada kondisi yang terlindung dari panas, uap air, dan oksigen Candolle 1832, diacu dalam Justice Bass 2002. Proses kematian benih dapat
terjadi secara perlahan-lahan sehingga nampaknya mustahil untuk menentukan kapan kehidupan benih itu berakhir. Justice dan Bass 2002, menyatakan bahwa
pada suatu kelompok benih, proses kehidupan individu benihnya tidak berlangsung dalam laju yang sama antara satu dengan yang lainnya pengaruh
genetik. Jika benih disimpan pada berbagai keadaan, proses kehidupan benih berakhir pada waktu yang tidak sama, kadang kala enzim-enzim tertentu masih
berfungsi untuk sementara meski benihnya telah mati. Begitu juga yang terjadi pada benih jelutung dalam penelitian ini. Meskipun mendapatkan perlakuan yang
sama dalam proses penyimpanannya pasca panen, tapi persentase kehidupan benih berbeda-beda setelah diberikan perlakuan secara in vitro. Hal ini diduga biji
Kategori