ke 96-well plate dan sebanyak 100 µL media kultur juga dimasukkan pada 3
sumuran sebagai kontrol media dan diinkubasi selama 24 jam. Menjelang akhir inkubasi, kondisi sel didokumentasikan terlebih dahulu. Media sel dibuang
dengan membalikkan plate diatas tempat buangan, plate ditekan secara perlahan di atas tisu untuk meniriskan sisa cairan dan
dicuci dengan 100 µL PBS. PBS dibuang dengan cara membalik plate dan meniriskan sisa cairan
de ngan tisu. Sebanyak 100 µL reagen MTT ditambahkan ke setiap sumuran
selama 2-4 jam dalam inkubator sampai terbentuk formazan. Kondisi sel diperiksa dengan mikroskop inverted. Sebanyak 100
µL larutan Stopper SDS 10 dalam 0,1 N HCl ditambahkan apabila sudah terbentuk formazan. Plate
dibungkus dengan kertas atau aluminuium foil dan diinkubasi di tempat gelap semalaman pada suhu ruangan. Absorbansi dibaca pada masing-masing
sumuran dengan ELISA reader pada λ = 595 nm, kemudian prosentase sel
hidup dihitung dan dilakukan analisis harga IC
50.
5. Uji apoptosis dengan metode Double Staining
a. Preparasi sel kanker WiDr
Sel kanker WiDr yang sudah konfluen diambil dari inkubator CO
2
dan dipanen. Cover slip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset
dengan hati- hati. Sebanyak 1000 µL suspensi sel dimasukkan tepat diatas cover
slip secara merata dan perlahan. Sel diamati di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Sel diinkubasi dalam inkubator selama semalam.
b. Perlakuan Double Staining Sampel pada Sel
Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. Semua media kultur dari sumuran dibuang dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Sel
WiDr dalam sumuran dicuci dengan masing- masing 500 µL PBS. PBS dibuang
dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan. Sebanyak 1 000 µL larutan
uji ekstrak etanol daun sirih dengan konsentrasi 794,23 µgmL dan 1000 µL
media kultur sebagai kontrol sel dimasukkan ke dalam sumuran. Sel diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam. Semua media dari sumuran dibuang dan dicuci
masing- masing dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan cover slip diambil
menggunakan pinset dengan bantuan ujung jarum dengan hati-hati. Cover slip diletakkan di atas object glass kaca obyek dan diberi label. Reagen campuran
ethidium bromide-akridin oranye 10 µL diteteskan di atas cover slip dan
diratakan dengan cara menggoyang secara perlahan, kemudian diamati di bawah mikroskop fluoresen dan didokumentasi.
6. Pengamatan ekpresi protein dengan metode Imunositokimia
a. Preparasi sel kanker WiDr
Sel kanker WiDr yang sudah konfluen diambil dari inkubator CO
2
dan dipanen. Cover slip dimasukkan kedalam 24-well plate menggunakan pinset
dengan hati-hati. Suspensi sel 10 00 µL dimasukan tepat diatas coverslip secara
merata dan perlahan. Keadaan sel dilihat di mikroskop untuk melihat distribusi sel. Sel diinkubasi dalam inkubator selama semalam.
b. Perlakuan uji imunositokimia ekstrak etanolik daun sirih pada sel WiDr
Sel WiDr dalam 24-well plate diambil dari inkubator. Semua media kultur dibuang dari sumuran dengan pipet Pasteur secara perlahan-lahan. Sel
WiDr dalam sumuran dicuci dengan masing- masing 500 µL PBS. PBS dari
sumuran dibuang dengan pipet Pasteur secara perlahan. Sebanyak 1000 µL
larutan uji ekstrak etanolik daun sirih hijau dengan konsentrasi 794,23 µgmL
dan 1000 µL media kultur sebagai kontrol sel dimasukkan kedalam sumuran.
Sel diinkubasi dalam inkubator selama 24 jam. Semua media dibuang dari sumuran dan masing-
masing dicuci dengan 500 µL PBS. PBS dibuang dan sebanyak 300
µL metanol dimasukkan kemudian diinkubasi selama 10 menit di inkubator. Metanol dibuang secara perlahan. Larutan hidrogen peroksida
blocking solution diteteskan kemudian diinkubasi selama 15-20 menit. Larutan dibuang dengan mikropipet dan dicuci dengan air aquadest dan PBS.
Prediluted blocking serum diteteskan dan diinkubasi selama 10-15 menit kemudian larutan dibuang. Antibodi monoklonal primer Lab Vision untuk
antibodi yang ingin diamati yaitu COX-2 di teteskan dan diinkubasikan selama 60 menit. Sebanyak 500
µL PBS ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit. PBS dibuang dan antibodi sekunder trek Avidin-HRP label diteteskan
kemudian diinkubasi selama 20 menit. Larutan dibuang. Reagen trek Avidin- HRP label diteteskan dan diinkubasi selama 10 menit. PBS
500 µL ditambahkan dan diinkubasi selama 5 menit dan PBS dibuang. Larutan DAB
diteteskan dan diinkubasikan selama 15 menit. Sebanyak 500 µL akuades
ditambahkan, kemudian dibuang. Larutan May Haemotoxylin diteteskan dan
diinkubasi selama 3 menit. Seb anyak 500 µL akuades ditambahakan kemudian
membuangnya kembali. Cover slip diangkat dengan pinset secara hati-hati dan dicelupkan dalam xylol dan alkohol. Cover slip dikeringkan dan diletakkan di
atas object glass, kemudian ditetesi dengan lem mounting media. Cover slip ditutup dengan cover slip kontak. Ekpresi protein diamati dengan mikroskop
cahaya.
F. Analisis Hasil
