diinkubasi selama 3 menit. Seb anyak 500 µL akuades ditambahakan kemudian
membuangnya kembali. Cover slip diangkat dengan pinset secara hati-hati dan dicelupkan dalam xylol dan alkohol. Cover slip dikeringkan dan diletakkan di
atas object glass, kemudian ditetesi dengan lem mounting media. Cover slip ditutup dengan cover slip kontak. Ekpresi protein diamati dengan mikroskop
cahaya.
F. Analisis Hasil
1. Uji MTT
Data yang didapat dari uji MTT, dihitung viabilitas selnya dengan
menggunakan rumus :
Data viabilitas sel di plotkan pada tabel kemudian IC
50
dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear konsentrasi vs viabilitas sel pada
Microsoft Excel 2007. Koefisien y pada persamaan linier ini menunjukkan koefisien IC
50
, sedangkan koefisien x menunjukkan konsentrasi ekstrak yang akan dicari
nilainya, dimana x yang diperoleh merupakan besarnya konsentrasi yang diperlukan untuk dapat menghambat viabilitas sel sebesar 50 Harmita,
2004.
2. Uji Double Staining
Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 40x10. Setiap preparat dihitung dalam tiga lapang pandang yang
berbeda. Sel yang berwarna hijau menunjukkan bahwa sel tersebut hidup. Sel utuh berwarna merah menunjukkan sel nekrosis sedangkan sel yang
terfragmentasi nukleusnya apoptosis ditunjukkan dengan warna oranye. Pembacaan dan perhitungan jumlah sel yang mengalami apoptosis, nekrosis
atau sel hidup pada preparat dibaca dengan bantuan tiga orang responden
blind reader. Hasil berupa rata-rata ± SD. 3.
Uji Immunositokimia
Ekspresi protein tertentu misal COX-2 ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma bukan inti sel. Pembacaan data dilakukan dengan
bantuan blind reader. Sebanyak tiga orang responden menghitung jumlah sel yang mengekspresikan COX-2 pada preparat yang terdiri dari tiga bagian tiap
preparatnya. Hasil berupa rata-rata ± SD.
Persentase sel yang mengekspresikan COX-2 dalam satu preparat dihitung dengan melakukan skoring. Tiga orang responden blind reader
membantu dalam membaca dan
menghitung persentase sel yang
mengekpresikan COX-2 pada tiap preparat. Hasil negatif apabila sel yang mengekspresikan COX-2 10 dari total sel dan hasil positif apabila sel yang
mengekspresikan COX-2 10 dari total sel. Nilai skor diberikan sesuai dengan persentase sel yang mengekspresikan COX-2; Skor - = 10; Skor +
= 25; Skor ++ = 50; Skor +++ = 75; dan Skor ++++ = 90
Zhang dan Sun, 2002.
Data penekanan ekpresi COX-2 yang didapat kemudian dianalisis secara statistik menggunakan uji Shapiro Wilk untuk mengetahui distribusi data
tiap kelompok kontrol sel, ekstrak etanol daun sirih, dan doksorubisin Immanuel, 2015. Apabila didapatkan data yang berdistribusi normal maka
dilakukan uji variansi menggunakan uji F-Test Sample of Variancespada program Microsof Excel 2007, yang kemudian dilanjutkan dengan T-Test :
Paired Two Sample for Means pada program Microsof Excel 2007 untuk mengetahui adanya kebermaknaan perbedaan penekanan ekpresi COX-2 pada
tiap kelompok. Apabila didapatkan data yang tidak berdistribusi normal maka dilakukan uji non-parametik menggunakan uji Kruskal-Wallis, yang
dilanjutkan dengan uji Man-Whitney untuk mengetahui kebermaknaan perbedaan
penekanan ekpresi
COX-2 pada
tiap kelompok.
34
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun sirih terhadap viabilitas sel kanker kolon WiDr dan diketahui nilai IC
50
yang digunakan untuk mengetahui kemampuan induksi apoptosis dan potensi
penekanan ekspresi COX-2. Uji secara in vitro dilakukan menggunakan metode MTT untuk mengetahui persentase viabilitas sel. Kematian sel secara apoptosis
dideteksi dengan metode double staining dan dilanjutkan dengan uji imunositokimia untuk melihat ekspresi COX-2 pada sel WiDr.
A. Determinasi Tanaman dan Penyiapan Ekstrak Daun Sirih
Penelitian ini menggunakan sampel berupa tanaman yaitu daun sirih. Langkah awal yang dilakukan dalam penelitian adalah determinasi tanaman sirih
yang bertujuan untuk memastikan kebenaran identitas tanaman yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu tanaman sirih Piper betle L.. Bagian tanaman yang
digunakan untuk determinasi merupakan bagian daun, batang, dan akar. Determinasi tanaman dilakukan di bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dan dibuktikan dengan adanya surat keterangan dengan No. : BF277IdentDetVI2014 Lampiran 5.
Proses selanjutnya adalah ekstraksi menggunakan metode maserasi untuk mendapatkan zat-zat aktif yang terdapat dalam daun sirih. Maserasi merupakan
ekstraksi tanpa pemanasan yang sederhana, sehingga cocok digunakan untuk ekstraksi senyawa-senyawa yang sensitif pada suhu tinggi. Prinsip maserasi
