Uji Apoptosis dengan Metode Double Staining

H. Uji Apoptosis dengan Metode Double Staining

Double-staining merupakan metode yang digunakan untuk uji apoptosis menggunakan akridin oranye dan etidium bromida AOEB untuk memvisualisasikan perubahan warna pada nukleus dan bentuk sel sebagai karekteristik dari apoptosis. Metode ini berdasarkan pada prinsip bahwa akridin oranye masuk ke dalam sel hidup dan sel mati, sedangkan etidium bromida hanya dapat menembus membran sel yang mengalami disintegrasi. Sel hidup berwarna hijau jika dibaca dibawah mikrokop floresens dan sel mati akan berwarna merah Kavanagh, 2007. Sel yang mengalami apoptosis dan membran blebbing, etidium bromida dapat masuk ke dalam sel dan memberikan warna oranye. Sel yang mengalami early apoptosis akan mengalami kondensasi atau fragmentasi kromatin dan memiliki nukleus berwarna hijau dan ada sedikit warna oranye. Sel yang mengalami late apoptosis memiliki kromatin berwarna oranye yang terkondensasi dan terfragmentasi terpecah-pecah menjadi bagian yang lebih kecil. Sel yang mati karena mengalami nekrosis memiliki nukleus berwarna merah dengan struktur normal. Warna yang ditimbulkan oleh etidium bromida pada sel mati lebih dominan jika dibandingkan dengan akridin oranye sehingga nukleus pada sel mati akan berwarna merah McGahon et al., 1995.

I. Imunositokimia

Imunositokimia dimulai pada penelitian yang dilakukan oleh Coons dan kawan-kawan pada tahun 1942 menggunakan antibodi yang dilabeli agen fluoresen untuk mendeteksi antigen pada hati. Penggunaan metode ini berkembang dari penggunaan antibodi pada metode enzyme-linked immunosorbent assay ELISA dan sebelumnya adalah radio immuno assay RIA. Imunositokimia adalah metode yang digunakan untuk mengidentifikasi antigen dengan interaksi antigen-antibodi spesifik. Pewarnaan sel merupakan metode yang sesuai untuk mendemonstrasikan keberadaan suatu molekul spesifik di dalam sel. Dalam metode ini, antibodi spesifik yang berikatan dengan antigen dideteksi dengan reagen sekunder yang berupa antibodi lain yang telah dilabeli fluophore atau enzim Richard, 2011. Metode imunositokimia terbagi menjadi dua yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna berikatan langsung dengan antigen pada sel disebut metode langsung. Metode tidak langsung yaitu apabila antigen diikat pada antibodi primer secara langsung, kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder berikatan dengan antibodi primer, kemudian ditambahkan substrat kromogen yang diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna yang mampu memberikan warna pada sel Richard, 2011. Ekspresi protein yang telah divisualisasikan dihitung berdasarkan jumlah sel yang mengekspresi protein tertentu dari keseluruhan sel dan dinyatakan dalam satuan . Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklatgelap, sedangkan yang tidak mengekspresikan protein tertentu memberikan warna ungubiru Dai et al., 2004. Imunositokimia dimanfaatkan untuk mengidentifikasi protein dan makromolekul lain pada tingkat sel. Sampel kontrol diperlukan untuk menunjukan lokasi pelabelan yang benar. Kontrol yang diperlukan untuk imunositokimia adalah kontrol antibodi primer yang menunjukan spesifitas antara antibodi primer dan antigen, kontrol antibodi sekunder untuk menunjukan spesifitas ikatan antara antibodi sekunder dan antibodi primer. Kontrol yang ketiga adalah kontrol label yang menunjukan bahwa pelabelan yang terjadi merupakan hasil dari label yang ditambahkan dan bukan dari label endogen Richard, 2011.

J. Landasan Teori