adalah ekstraksi zat aktif yang dilakukan dengan cara merendam serbuk dalam penyari yang sesuai pada suhu ruang dan terlindung dari cahaya. Cairan
penyari masuk kedalam rongga sel yang mengandung zat aktif, sehingga terjadi perbedaan konsentrasi antara zat terlarut didalam sel dengan yang diluar
sel maka larutan didalam sel didesak keluar dan hal ini terjadi berulang-ulang sehingga tercapainya kesetimbangan konsentrasi antara larutan yang ada di
dalam dan di luar sel. Pelarut yang digunakan adalah etanol 70. Hasil uji fitokimia ekstrak etanol daun sirih mengandung senyawa tanin, antrakuinon,
flavonoid, alkaloid, terpenoid, dan saponin Kumari dan Rao, 2014. Daun sirih berpotensi memiliki aktivitas sitotoksik karena mengandung senyawa flavonoid,
antrakuinon, dan alkaloid yang dikenal memiliki aktivitas antikanker Hasballah, 2005; Jusril, dkk., 2003; Astuti, dkk., 2005. Penelitian Lin, dkk., 2006
menyebutkan bahwa flavonoid merupakan senyawa polifenol yang secara in vitro dapat menghambat proliferasi sel kanker kolon. Flavonoid dapat terlarut oleh
pelarut polar seperti air dan etanol karena mempunyai gugus hidroksil. Ekstrak etanol daun sirih berwarna hijau pekat karena kandungan klorofil yang terdapat
pada daun sirih juga ikut terekstrak.
B. Uji Sitotoksik Ekstrak Etanolik Daun Sirih terhadap Sel Kanker WiDr
Uji aktivitas antikanker ekstrak etanol daun sirih terhadap sel kanker kolon WiDr dilakukan dengan metode MTT. Metode MTT dipilih karena sensitif,
relatif cepat, akurat, dan digunakan untuk mengukur sampel dalam jumlah besar.
Metode MTT merupakan metode kolorimetri berdasarkan perubahan warna garam tetrazolium menjadi formazan dalam mitokondria yang aktif pada sel hidup. MTT
diabsorbsi oleh sel hidup dan dipecah oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium pada respirasi mitokondria Doyle dan Griffiths, 2000 menghasilkan warna ungu
yang menandakan adanya perubahan MTT menjadi kristal formazan. Warna ungu yang dihasilkan proporsional dengan jumlah sel yang masih hidup viabilitas sel.
A B
C D
Gambar 6. Efek sitotoksik ekstrak daun sirih hijau terhadap sel WiDr.
Keterangan: Konsentrasi ekstrak etanol daun sirih hijau A 2000 µgmL, B 500 µgmL,
C 5 µgmL D kontrol sel. Pengamatan dilakukan dibawah mikroskop inverted perbesaran 400x.
Perbedaan morfologi sel semakin terlihat setelah pemberian MTT. sel hidup: ; sel mati:
Morfologi sel kanker WiDr yang diamati dibawah mikroskop inverted menunjukkan bahwa populasi sel WiDr pada kelompok kontrol sel hidup terlihat
lebih cerah karena sitoplasmanya mengandung cairan sitoplasma yang dapat meneruskan cahaya dari mikroskop inverted Gambar 6D, sel menempel satu
dengan yang lain, memiliki bentuk bulat dan terlihat menempel di dasar plate. Dilihat dari morfologi selnya Gambar 6
A pada konsentrasi ekstrak 2000 µgmL, sel yang mati terlihat mengambang, pada bagian pinggir sel berwarna gelap,
bagian tengah terlihat kosong, kepadatan sel berkurang, dan tidak saling menempel. Sel yang mati memiliki warna lebih gelap dan berbentuk bulat, hal ini
terjadi karena sel kehilangan sitoplasma akibat rusaknya membran sel, sehingga sel tidak dapat meneruskan cahaya dari mikroskop. Pada konsentrasi ekstrak 500
µgmL sel terlihat lebih padat dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak 2000 µgmL dan tidak saling menempel Gambar 6B, sedangkan pada konsentrasi 5
µgmL, kepadatan populasi mendekati kepadatan kontrol sel yang menandakan viabilitas sel masih tinggi.
Berdasarkan hasil uji aktivitas antikanker ekstrak etanol daun sirih terhadap sel kanker kolon WiDr, maka dapat diketahui nilai IC
50
. Nilai IC
50
menunjukkan konsentrasi ekstrak etanol daun sirih yang mampu menghambat pertumbuhan 50 sel kanker WiDr. viabilitas sel dapat diketahui dengan
ELISA reader. Hasil ELISA reader adalah data absorbansi yang dikonversikan sebagai nilai viabilitas sel. Efek ekstrak etanol daun sirih terhadap sel kanker
kolon WiDr diketahui dengan membuat tabel korelasi antara konsentrasi ekstrak
dan viabilitas sel Gambar 5.
Gambar 5. Kurva hubungan viabilitas sel terhadap konsentrasi ekstrak etanol daun sirih
Aktivitas anti kanker ekstrak etanol daun sirih berpola dose dependent yaitu viabilitas sel menurun seiring kenaikan konsentrasi sampel. Perhitungan
dilakukan dengan regresi linear menggunakan Microsoft Excel 2007 pada 3 titik konsentrasi yaitu 250
µgmL, 500 µgmL, dan 1000 µgmL dan didapatkan persamaan linear y = -0,104x + 132,63 dengan R = 0,992. Sensitivitas ekstrak
etanol daun sirih terhadap sel kanker WiDr diukur melalui nilai IC
50
. Berdasarkan persamaan linear diperoleh nilai IC
50
ekstrak etanol daun sirih adalah 794,23 µgmL Menurut NCI National Cancer Institute, suatu ekstrak dinyatakan
memiliki aktivitas antikanker tinggi apabila memiliki nilai IC
50
30 µgmL,
memiliki aktivitas antikanker sedang apabila memiliki 30 µgmL ≤ IC
50
100 µgmL dan tidak aktif apabila nilai IC
50
100 µgmL Zheng, dkk., 2000,
sehingga dapat dikatakan bahwa ekstrak etanol daun sirih menurut NCI tidak memiliki aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker kolon WiDr. Nilai IC
50
yang tidak poten diduga karena kompleksitas senyawa yang terkandung didalam
ekstrak etanol daun sirih, namun ekstrak etanol daun sirih tetap memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai antikanker dan dilanjutkan dengan uji double
staining dan imunositokimia karena dalam penelitian Awik, Sukardiman, dan Tri 2011 yang menguji sitotoksisitas dan efek ekstrak spon laut Aaptos
suberitoides terhadap sel kanker payudara T47D dihasilkan nilai IC
50
sebesar 528,828 µgmL dan dilanjutkan dengan pengujian double staining dan
imunositokimia. Nilai IC
50
ekstrak etanol daun sirih dibandingkan dengan nilai IC
50
doksorubisin. Doksorubisin merupakan antibiotik golongan antrasiklin yang diisolasi dari kultur Streptomyces peucetiusvarcaesius Minotti,dkk., 2004 dan
merupakan agen kemoterapi yang secara luas dipakai untuk berbagai macam kanker Lupertz, dkk., 2010. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Immanuel
2015 nilai IC
50
doksoribisin pada sel kanker kolon WiDr adalah 21,44 µgmL. Nilai IC
50
doksorubisin terhadap kanker kolon WiDr jauh lebih rendah toksik apabila dibandingkan dengan perlakuan ekstrak etanol daun sirih. Morfologi sel
yang mengalami perubahan perlu dianalisis lebih lanjut untuk mengetahui kemampuan ekstrak etanol daun sirih dalam menginduksi apoptosis sel kanker
kolon WiDr pada konsentrasi IC
50
. Nilai IC
50
yang tinggi pada penelitian ini diduga disebabkan oleh kandungan beta karoten dalam ekstrak etanol daun sirih. Penelitian yang
dilakukan oleh Andarwulan 1995 menunjukkan bahwa daun sirih yang diekstrasi menggunakan heksan-etanol mengandung senyawa beta karoten.
Penelitian Wolf dan George 2002 menegaskan pengaruh beta karoten terhadap pertumbuhan tumor pada paru-paru yang diujikan pada musang, dinyatakan
bahwa pemberian beta karoten pada dosis tinggi 2,4 mgkg BB per hari selama enam bulan dapat menyebabkan perkembangan proliferasi sel alveolar dan
metaplasia keratinisasi skuamosa. Daun sirih juga mengandung minyak atsiri Moeljanto dan Mulyono, 2003 yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan
Parwata, dkk., 2009, tetapi pada penelitian Sayin, dkk., 2014 menunjukkan bahwa senyawa antioksidan memiliki aktivitas sebagai prokarsinogenik. Pada
kolon yang mengalami adenoma diketahui jumlah protein p53 mengalami penurunan akibat mutasi dan penekanan oleh antioksidan sehingga memicu
peningkatkan proliferasi sel kanker.
C. Uji Apoptosis Ekstrak Etanolik Daun Sirih dengan Metode Double Staining
