well plate Nunc, 24-well plate Nunc, pipet Pasteur, ELISA reader SLT 240 ATC, laminar air flow cabinet Labconco, mikroskop inverted Olympus,
mikroskop flourosens Zeiss MC 80, kamera digital Canon DSLR 1000D, haemocytometer Neubauer, yellow tips, blue tips, eppendorf Plasti brand,
tissue, glove, pinset, dan masker.
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi tanaman sirih yang didapatkan di Sleman Yogyakarta dilakukan di Bagian Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah
Mada Yogyakarta, dengan membandingkan ciri morfologi tanaman sirih
dengan pustaka acuan menurut Becker dan Bakhuizen 1965. 2.
Pembuatan simplisia
Daun sirih dicuci bersih dengan air mengalir dan dikeringkan menggunakan oven pada suhu maksimal 60-70
C. Daun sirih yang sudah kering dan dapat dihancurkan dengan tangan. Daun sirih kering diserbukan di
Merapi Farma, Kaliurang Yogyakarta. 3.
Ekstraksi daun sirih hijau dengan metode maserasi
Sebanyak 100 mg serbuk simplisia daun sirih direndam dalam 1000 mL etanol 70 dalam Erlenmeyer yang tertutup dan dikondisikan selama 24
jam dalam keadaan terlindung dari cahaya matahari sambil diaduk selama 6 jam pertama menggunakan shaker. Maserat diambil, disaring, dan ditampung
dalam tabung Erlenmeyer tertutup supaya terlindung dari cahaya matahari.
Ampas serbuk sirih hijau yang tertinggal diperas dan ditambah cairan penyari 1000 mL etanol 70 kemudian dimaserasi menggunakan shaker selama 6 jam
pertama dan dibiarkan selama 24 jam. Maserat setelah 24 jam diambil dan disaring menggunakan kertas saring kemudian digabungkan dengan maserat
sebelumnya. Maserat yang terkumpul dipekatkan menggunakan rotary evaporator. Hasil evaporasi dituangkan ke dalam cawan porselen kemudian
dipanaskan di atas waterbath dengan suhu 80 C untuk mendapatkan ekstrak
etanol daun sirih yang kental. 4.
Uji sitotoksisitas ekstrak daun sirih Piper betle L. terhadap sel kanker kolon WiDr dengan metode MTT
a. Preparasi sel kanker kolon WiDr
Sel WiDr diambil dari tangki nitrogen dan dicairkan dalam penangas air dengan suhu 37
C. Ampul disemprot dengan etanol 70 dan dimasukkan dalam LAF. Ampul dibuka dan sel WiDr dipindahkan ke dalam conical tube
steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifugasi dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit supernatan yang terbentuk dibuang.
Medium RPMI 1640 yang baru ditambahkan kedalam suspensi sel dan disentrifugasi kembali selama 5 menit hingga homogen kemudian dicuci ulang
sekali lagi. Suspensi sel WiDr yang didapatkan,ditambahkan dengan 1 mL medium penumbuh sel yang mengandung 10 FBS dan diresuspensi kembali
secara perlahan hingga homogen. Sel WiDr ditambahkan dalam tissue culture flask kecil dan diinkubasi dalam inkubator CO
2
dengan suhu 37 C. Medium
kultur WiDr diganti setelah 24 jam. Sel WiDr ditumbuhkan hingga 80
kofluen dan jumlahnya cukup untuk uji yang dilakukan. Medium kultur dibuang setelah sel WiDr konfluen. Sel WiDr dicuci dengan 3,5 mL PBS
sebanyak 2 kali kemudian ditambahkan dengan Tripsin-EDTA 300 L dan
diinkubasi selama 3 menit dalam inkubator CO
2
. Sebanyak 5 mL media kultur ditambahkan dan sel WiDr diresuspensikan hingga terlepas seluruhnya dari
dinding flask. Suspensi sel dipindah ke dalam conical tube steril baru. Sel
WiDr dihitung dengan haemocytometer dan cell counter.
b. Preparasi larutan uji ekstrak daun sirih
Ekstrak daun sirih ditimbang kurang lebih 50 mg dan dimasukkan dalam eppendorf. Ekstrak tersebut dilarutkan dalam 1 mL DMSO dan divortek
hingga homogen untuk mendapatkan larutan ekstrak induk konsentrasi 1 mgmL. Larutan induk diencerkan dengan media kultur hingga diperoleh seri
konsentrasi 5 µgmL, 10 µgmL, 100 µgmL, 250 µgmL, 500 µgmL, 1000 µgmL, 2000 µgmL
c. Uji sitotoksik dengan metode MTT
96-well plate yang berisi sel diambil dari inkubator. Keadaan dan distribusi sel diamati di mikroskop kemudian didokumentasikan. Media dalam
sumuran dibuang dengan membalikkan plate 180 di atas tempat pembuangan,
plate secara perlahan ditekan di atas tisu untuk meniriskan sisa cairan dan dicuci dengan PBS sebanyak 100
µL, kemudian PBS dibuang dengan cara membalikan plate
dan meniriskan sisa cairan dengan tisu. Sebanyak 100 µL seri konsentrasi ekstrak etanolik daun sirih
dengan kadar 5 µgmL, 10 µgmL, 100 µgmL, 250 µgmL, 500 µgmL, 1000 µgmL, 2000 µgmL, dimasukkan
ke 96-well plate dan sebanyak 100 µL media kultur juga dimasukkan pada 3
sumuran sebagai kontrol media dan diinkubasi selama 24 jam. Menjelang akhir inkubasi, kondisi sel didokumentasikan terlebih dahulu. Media sel dibuang
dengan membalikkan plate diatas tempat buangan, plate ditekan secara perlahan di atas tisu untuk meniriskan sisa cairan dan
dicuci dengan 100 µL PBS. PBS dibuang dengan cara membalik plate dan meniriskan sisa cairan
de ngan tisu. Sebanyak 100 µL reagen MTT ditambahkan ke setiap sumuran
selama 2-4 jam dalam inkubator sampai terbentuk formazan. Kondisi sel diperiksa dengan mikroskop inverted. Sebanyak 100
µL larutan Stopper SDS 10 dalam 0,1 N HCl ditambahkan apabila sudah terbentuk formazan. Plate
dibungkus dengan kertas atau aluminuium foil dan diinkubasi di tempat gelap semalaman pada suhu ruangan. Absorbansi dibaca pada masing-masing
sumuran dengan ELISA reader pada λ = 595 nm, kemudian prosentase sel
hidup dihitung dan dilakukan analisis harga IC
50.
5. Uji apoptosis dengan metode Double Staining
