bahwa pemberian beta karoten pada dosis tinggi 2,4 mgkg BB per hari selama enam bulan dapat menyebabkan perkembangan proliferasi sel alveolar dan
metaplasia keratinisasi skuamosa. Daun sirih juga mengandung minyak atsiri Moeljanto dan Mulyono, 2003 yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan
Parwata, dkk., 2009, tetapi pada penelitian Sayin, dkk., 2014 menunjukkan bahwa senyawa antioksidan memiliki aktivitas sebagai prokarsinogenik. Pada
kolon yang mengalami adenoma diketahui jumlah protein p53 mengalami penurunan akibat mutasi dan penekanan oleh antioksidan sehingga memicu
peningkatkan proliferasi sel kanker.
C. Uji Apoptosis Ekstrak Etanolik Daun Sirih dengan Metode Double Staining
Mekanisme kematian sel dibagi menjadi dua yaitu melalui mekanisme apoptosis dan nekrosis. Pengamatan terhadap kematian sel dilakukan dengan
menggunakan metode double staining. Metode ini berdasarkan pada perbedaan fluorosensi DNA pada sel yang hidup dan mati karena pengikatan Etidium
Bromida – Akridin Oranye. Konsentrasi yang digunakan pada uji ini sesuai dengan nilai IC
50
yang didapat dari uji MTT. Akridin oranye dapat masuk ke dalam sel hidup dan mati. Akridin oranye mengandung gugus kation sehingga
dapat berinteraksi dengan DNA sel hidup yang berifat anionik, membentuk garam terdisosiasi dan menghasilkan warna fluoresensi hijau, sedangkan etidium
bromida hanya bisa masuk kedalam sel yang membran plasmanya sudah rusak karena sel yang apoptosis mengalami blebbing sehingga membran sel tidak
permeabel, kemudian akan berikatan dengan RNA atau DNA untai tunggal dan menghasilkan fluororesensi oranye dilihat dengan mikroskop fluororesens. Warna
yang ditimbulkan etidium bromida lebih dominan daripada akridin oranye Meiyanto, dkk., 2008. Pada kelompok kontrol, membran sel dalam keadaan utuh
tidak rusak sehingga hanya akridin oranye yang bisa masuk dan menghasilkan floresensi hijau Gambar 7A. Beberapa sel WiDr yang mati pada kelompok
kontrol, hal ini dimungkinkan karena kurangnya nutrisi untuk sel WiDr bertahan hidup. Pada kelompok perlakuan, terlihat bahwa sel WiDr mengalami apoptosis
yang ditandai rusaknya membran sel dan inti sel yang terfragmentasi. Kerusakan membran sel ini menyebabkan etidium bromide dapat masuk ke dalam sel dan
menghasilkan floresensi oranye, namun tidak semua sel WiDr pada kelompok perlakuan mengalami apoptosis Gambar 7B, hal serupa juga ditunjukkan pada
perlakuan ekstrak dengan doksorubisin Gambar 7C. Sel yang mengalami apoptosis akan berwarna oranye dan nukleus mengalami fragmentasi fase late
apoptosis. Pada fase early apoptosis, sel mengalami kondensasi inti yang ditunjukkan dengan adanya warna oranye pada nukleus, sehingga tampak sel
berwarna hijau bercampur oranye. Hal tersebut terjadi karena sel mulai mengalami membran blebbing, sehingga etidium bromida mulai masuk ke dalam
sel Pebriana, dkk., 2008. Pada penelitian ini tidak ditemukan sel yang mengalami fase early apoptosis. Sel yang mati nekrosis berwarna merah
ditunjukkan dengan panah berwarna biru dan bentuk sel dalam keadaan utuh. Sel yang mati nekrosis membran plasmanya pecah, sehingga jumlah etidium
bromida dan akridin oranye yang masuk kedalam sel lebih banyak dari pada sel
yang mengalami apoptosis dan warna yang dihasilkan semakin kuat. Dari hasil metode double staining ini dapat disimpulkan bahwa ekstrak etanol daun sirih
dapat menginduksi apoptosis walaupun tidak sebesar doksorubisin.
A B
C
Gambar 7. Hasil Uji Double Staining Ekstrak Etanol Daun Sirih.
Keterangan: Kontrol sel A, perlakuan dengan ekstrak daun sirih 794,23 µgmL B, perlakuan
dengan do ksorubisin konsentrasi 21 µgmL.
Sel Hidup Nekrosis Apoptosis
Tabel I. Distribusi sel WiDr pada uji apoptosis dengan metode double staining Sel
Hidup ± SD Nekrosis ± SD
Apoptosis ± SD Kontrol Sel
99,60 ± 0,37 0,37±0,38
Ekstrak Etanol Daun Sirih
16,98±1,02 11,6±4,5
71,44 ± 4,4
Doksorubisin 5,42 ± 0,0005
2,98 ± 2,59 92,92 ± 2,20
Uji double staining merupakan uji kualitatif dan dapat dijadikan sebuah
uji semi-kuantitatif dengan syarat terdapat minimal tiga buah foto gambaran
keadaaan sel dalam satu preparat yang dianggap mewakili seluruh keadaan sel dalam satu preparat. Hasil diketahui dengan bantuan blind reader. Tiga orang
diminta untuk menghitung jumlah sel yang mengalami apoptosis, nekrosis, dan sel hidup tanpa mengetahui perlakuan yang diberikan terhadap sel yang diamati.
Tabel I perlakuan ekstrak etanol daun sirih menunjukkan sel yang mengalami apoptosis sebanyak 71,4 ± 5,5 sel. Penelitian yang dilakukan oleh Immanuel
2015 didapatkan presentase apoptosis doksorubisin terhadap kanker kolon WiDr sebesar 92,92 ± 2,20, hal ini menunjukkan ekstrak etanol daun sirih dapat
menginduksi apoptosis walaupun tidak sebesar doksorubisin. Setelah dilakukan uji double staining terhadap ekstrak etanol daun sirih, analisis aktivitas antikanker
dilanjutkan menggunakan metode imunositokimia untuk mengetahui interaksi molekuler ekstrak etanol daun sirih terhadap COX-2.
D. Uji Penekanan Ekspresi COX-2 oleh Ekstrak Etanolik Daun Sirih dengan Metode Imunositokimia
