Berbagai penelitian telah dilakukan untuk memeriksa pengaruh ketebalan penjerap terhadap kualitas pemisahan tetapi ketebalan yang paling sering dipakai
adalah 0,5 – 2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x40 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi
jumlah bahan yang dipisahkan dengan KLTP. Penjerap yang paling umum ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun
campuran senyawa hidrofil. Keefisienan pemisahan dapat ditingkatkan dengan cara pengembangan
berulang. Jika pemisahan secara KLTP telah dicapai, pelat dikeringkan dan kemudian dimasukkan lagi ke dalam bejana. Bergantung pada Rf pita, proses ini
dapat diulang beberapa kali, walaupun ada kerugian waktu. Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluoresensi yang
membantu kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap sinar UV. Untuk senyawa yang tidak menyerap sinar UV, ada beberapa
pilihan: a menyemprot dengan air,
b menutup pelat dengan sepotong kaca menyemprot salah satu sisi dengan pereaksi semprot,
c menambahkan senyawa pembanding Hostettmann, 1995. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari pelat dengan spatula
atau pengerok berbentuk tabung yang disambungkan ke pengumpul vakum. Cara terakhir tidak dapat dilakukan untuk senyawa peka karena penjerap yang
mengandung senyawa yang sudah murni terus menerus terkena aliran udara dan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
resiko otooksidasi selalu ada. Kemudian senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan pelarut sekitar 5 ml untuk 1 g penjerap. Harus diperhatikan bahwa makin
lama senyawa berkontak dengan penjerap makin besar kemungkinan penguraian Hostettmann, 1995.
G. Spektroskopi Ultra Violet UV
Spektroskopi ultra violet merupakan salah satu dari metode analisis yang digolongkan dalam metode spektroskopi yang memakai sumber radiasi
elektromagnetik UV dekat 190-380 nm dengan memakai instrumen spektrofotometer Mulja dan Suharman, 1995. Pada umumnya konfigurasi dasar
setiap spektrofotometer UV berupa susunan peralatan optik yang terkonstruksi dengan susunan tertentu gambar 3.
Gambar 3 : Bagan spektrofotometer UV berkas ganda Skoog, et al, 1998
Dasar dari metode ini adalah interaksi antara radiasi elektromagnetik dengan atom, molekul atau ion. Dalam praktek spektrofotometri UV untuk
sebagian besar dibatasi pada sistem terkonjugasi Mulja dan Suharman, 1995. Analisis kuantitatif spektroskopik berdasarkan hubungan antara jumlah
cahaya yang diabsorpsi dan konsentrasi senyawa pengabsorpsi. Banyaknya cahaya PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
yang diserap pada frekuensi atau panjang gelombang tertentu sesuai dengan jumlah molekul yang ada. Hal ini menentukan banyaknya intensitas serapan yang
dinyatakan sebagai transmitan T, didefinisikan sebagai berikut: T =
Io I
= 10
- ε.b.c
………………………………. 1 dimana I
o
adalah intensitas dari energi pancaran yang mengenai cuplikan, I adalah intensitas pancaran yang keluar dari cuplikan, c adalah konsentrasi,
ε adalah daya serap molar dan b adalah panjang sel.
Rumusan tersebut disempurnakan dalam Hukum Lambert-Beer yang menyatakan hubungan antara transmisi dengan tebal cuplikan dan konsentrasi
bahan penyerap. Hubungan tersebut dinyatakan sebagai: A = log
T 1
= a.b.c …………………............... 2 Keterangan:
T = persen
transmitan a
= daya serap Lg.cm c
= kadar zat gL b
= panjang sel cm A
= serapan
Anonim, 1995b.
Harga ε didefinisikan sebagai daya serap molar. Harga ε adalah
karakteristik untuk molekul atau ion penyerap dalam pelarut tertentu, pada panjang gelombang tertentu dan tidak bergantung pada konsentrasi dan panjang
gelombang lintasan radiasi Sastrohamidjojo, 2001. ε =
dimana c dalam molL. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Bila diketahui konsentrasi c larutan dalam gram per liter gL, maka persamaan Lambert-Beer dapat ditulis menjadi,
A = A1,1cm.b.c …………………………… 3 A adalah serapan; A1,1cm adalah serapan jenis dari larutan 1 zat terlarut
dalam sel dengan ketebalan 1 cm; b adalah panjang sel dalam cm; dan c adalah kadar dalam gL zat Anonim, 1995b.
Suatu molekul dapat menyerap radiasi elektromagnetik bila mempunyai kromofor yakni gugus penyerap dalam molekul. Pada senyawa organik dikenal
pula gugus auksokrom yaitu gugus fungsional yang tidak menyerap radiasi namun bila terikat bersama kromofor dapat meningkatkan penyerapan oleh kromofor atau
merubah panjang gelombang serapan dan intensitas ketika bergabung dengan kromofor, misal –OCH
3,
-Cl, -OH dan –NH
3
Christian, 2004. Pergeseran serapan ada 4 macam yaitu pergeseran batokromik, pergeseran
hipsokromik, hiperkromik, dan hipokromik. Pergeseran batokromik adalah pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih panjang disebabkan substitusi
atau pengaruh pelarut. Pergeseran hipsokromik adalah pergeseran ke arah panjang gelombang yang lebih pendek disebabkan substitusi atau pengaruh pelarut,
misalnya dari pelarut nonpolar ke pelarut polar Sastrohamidjojo, 2001. Efek hiperkromik adalah kenaikan intensitas serapan. Efek hipokromik adalah
penurunan intensitas serapan Connors, 1982. Transisi elektronik senyawa organik yang dapat terjadi yaitu transisi dari
orbital σ→ σ
, π→ π
, n → σ
, n → π
yang ditunjukkan oleh gambar berikut: PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
