penelitian dengan literatur mungkin karena fase diam yang dipakai berbeda, juga kondisi percobaan yang berbeda karena pada penelitian suhu yang dipakai adalah
suhu ruangan ± 25-27°C, sehingga memungkinkan terjadinya Rf lebih tinggi. Selain itu dari hasil penelitian sebelumnya tentang saponin, menyatakan bahwa
hRf saponin triterpenoid golongan β-amirin sekitar 55 dengan warna kebiruan
setelah dideteksi dengan anisaldehid-asam sulfat Yanuarsih, 2001.
H. Isolasi Saponin dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif
Isolasi dengan kromatografi lapis tipis preparatif dilakukan untuk memperoleh isolat yang mengandung saponin yang dimaksud. Fase diam yang
digunakan adalah silika gel GF
254
pada plate kaca 20 x 20 cm. Fase gerak yang digunakan pada tahap pertama adalah kloroform:metanol 95:5 vv karena pada
KLT pendahuluan menghasilkan pemisahan yang cukup baik. Setelah pengembangan berulang sebanyak 2x, hasil eluasi yang menunjukkan Rf yang
sama dengan KLT pendahuluan kemudian dikerok dengan hati-hati menggunakan spatula dan dikumpulkan. Pengembangan berulang dimaksudkan untuk mencapai
keefisienan pemisahan, karena semakin banyak dilakukan pengembangan berulang, pemisahan senyawa semakin baik. Dalam penelitian ini, 2x
pengembangan sudah menghasilkan pemisahan yang cukup baik karena bercak yang didapat terlihat jelas dan tidak terlalu dekat satu sama lain, sehingga lebih
mudah untuk dikerok. Hasil kerokan kemudian disaring dengan kloroform menggunakan sinterred glass lalu diuapkan. Jumlah fase diam yang digunakan
pada isolasi ini sejumlah 5 plate dengan maksud agar isolat yang didapat lebih banyak. Jumlah kloroform yang digunakan untuk menyari adalah 5 x 20 ml
berdasarkan alasan bahwa untuk menyaring menggunakan sinterred glass hasil kerokan harus benar-benar terendam oleh pelarut, dan dilakukan minimal 3x
sehingga penyaringan dilakukan sebanyak 5x. Isolat tahap pertama yang didapatkan kemudian diisolasi kembali dengan
metode yang sama. Fase diam yang digunakan sama dengan sebelumnya, namun fase gerak yang dipakai adalah n-butanol:etanol:air 7:2:5 vv alasannya karena
ternyata setelah isolat tahap pertama diuji kemurniannya dengan fase gerak tersebut, masih bisa terpisahkan menjadi 2 bercak dengan Rf sekitar 0,8 berwarna
biru ungu dan Rf sekitar 0,88 berwarna coklat gambar 10. Hal ini dapat terjadi kemungkinan karena kekuatan pemisahan fase gerak ini paling baik. Dengan
begitu maka akan timbul pertanyaan mengapa pada KLT pendahuluan, fase gerak ini tidak digunakan. Hal tersebut karena pada KLT pendahuluan, yang ditotolkan
adalah ekstrak kloroform kecambah kedelai dan Succus Liquiritae yang pekat, sehingga fase gerak ini malah tidak cukup baik memisahkan.
