Tempat dan Waktu Penelitian Populasi Penelitian Sampel Penelitian Jadwal Penelitian

3.3 Desain Penelitian

Desain yang digunakan pada penelitian ini adalah penelitian eksperimental true experiment design dengan rancangan Randomized Post-test Only Control Group Design, menggunakan kelompok kontrol dan kelompok perlakuan dengan randomisasi sederhana.

3.4 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara dan Laboratorium Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam FMIPA Univesitas Sumatera Utara USU Medan. Lama waktu penelitian dilaksanakan selama delapan minggu, dimulai sejak awal persiapan penelitian di pertengahan bulan Februari 2012 sampai pembuatan sediaan histopatologi jaringan aorta abdominalis pertengahan bulan April 2012.

3.5 Populasi Penelitian

Adapun populasi penelitian ini adalah hewan percobaan tikus jantan galur wistar yang berumur 10-12 minggu dengan berat 150-250 gram, dimana diperoleh dari Animal House Laboratorium Biologi FMIPA USU Medan. Universitas Sumatera Utara

3.6 Sampel Penelitian

Sampel Penelitian adalah minimal 25 ekor tikus wistar jantan yang dipilih dengan teknik acak sederhana. Sampel dikelompokkan atas 5 kelompok, yaitu kelompok I sebagai kontrol negatif dan kelompok II sebagai kontrol positif, sedangkan kelompok III, IV dan V adalah kelompok perlakuan. Penentuan besar sampel ditentukan dengan rumus Federer Baihaki A, Sudrajat M;1997, sebagai berikut: { t-1 n- 1 } ≥ 15 Dimana : n = besar sampel dalam kelompok, t = banyaknya kelompok sampel dari perhitungan diperoleh besar sampel tiap kelompok minimal : { 5-1 n- 1 } ≥ 15 4 n- 1 ≥ 15 4n- 4 ≥ 15 4n ≥ 19 n ≥ 5 maka besar semua sampel untuk 5 kelompok minimal adalah 25 ekor tikus jantan. 3.7 Kriteria Inklusi, Eksklusi dan Drop Out 3.7.1 Kriteria Inklusi 1. Tikus dalam kondisi sehat 2. Tikus tidak memiliki kelainan anatomis Universitas Sumatera Utara 3. Berat badan tikus normal berkisar 150-250 gram dan berumur sekitar 12 minggu

3.7.2 Kriteria Eksklusi

1. Tikus mengalami penurunan berat badan 2. Tikus mengalami diare 3. Tikus mati saat penelitian berlangsung

3.7.3 Drop Out

Tikus dinyatakan drop out apabila memenuhi kriteria eksklusi dan diganti dengan tikus lain sesuai kriteria inklusi sehingga didapatkan jumlah tikus yang tetap sesuai dengan perhitungan jumlah sampel penelitian ini. 3.8 Variabel penelitian 3.8.1 Klasifikasi Variabel Variabel bebas : pemberian jus buah pepaya dosis 2,6 gramekorhari Variabel tergantung : jumlah sel busa pada lapisan intima dan ketebalan dinding pembuluh darah aorta abdominalis Universitas Sumatera Utara

3.8.2 Defenisi Operasional Variabel

a. Pemberian jus buah pepaya adalah pemberian hasil proses pengolahan buah pepaya matang Carica Papaya L yang didapat dengan teknik pembuatan jus buah yaitu buah pepaya matang dikupas dan dicuci bersih dibawah air mengalir, dibuang bijinya dan di blender dengan menggunakan juicer extractor Cosmos CJ.355. b. Tikus hiperkolesterolemik adalah tikus wistar jantan berumur sekitar 12 minggu dengan kadar kolesterol total 120 mgdl.Sinnik FL et al,1990. Abnormalitas diukur berdasarkan kadar kolesterol total dalam serum darah tikus setelah diberi pemberian kuning telur 5 gram 200 gram BB melalui sonde lambung setiap hari sesuai dengan metode Constantinides yang dimodifikasi Kustiyah I, Prasetyo A,2003. Skala nominal, dengan nilai 1 jika diberi diet kuning telur dan 0 jika tidak diberi kuning telur setiap hari. c. Sel busa adalah sel-sel besar didaerah subintima, dimana pada mulanya adalah makrofag yang memakan lemak dan kemudian mengalami kematian inti selnya.Japardi,2002. Jumlah sel busa adalah hasil perhitungan sel busa yang ada di tunika intima sampai tunika media secara kuantitatif pada potongan melintang aorta abdominalis setebal 5 mikron dengan dan pengecatan rutin Hematoksilin-Eosin HE Skala rasioKustiyah, Prasetyo,2003; Sampurno,2003 Universitas Sumatera Utara d. Ketebalan dinding aorta abdominalis adalah hasil pengukuran ketebalan dinding aorta abdominalis pada potongan penampang melintang yang dipulas dengan pewarnaan HE, dari tunika intima sampai dengan tunika adventitia, dengan satuan ukuran mikron. Pengukuran dilakukan di delapan zona lapangan pandang yang diamati dengan mikroskop yang dilengkapi dengan lensa linier ocular micrometer, dengan pembesaran 400 kali sesuai dengan metode yang dipakai oleh Tjarta, Kustiah dan Prasetyo Fadhilah, Prasetyo,2001; Kustiyah,Prasetyo,2003. Skala rasio. Penentuan skala pengukuran dilakukan untuk menentukan analisis statistic yang akan dipakai. 3.9 Alat dan Bahan 3.9.1 Alat 1. Kandang tikus individual beserta perlengkapannya 2. Timbangan hewan percobaan OHAUS dan timbangan analitik 3. Sonde lambung ukuran kecil 4. Alat pembuatan jus buah pepaya : juicer, filter, botol kaca biasa, pipet 5. Alat alat untuk pembuatan sediaan histologi aorta abdominalis

3.9.2 Bahan

1. Emulsi kuning telur 5 mg200 gr. 2. Pakan tikus standar CP 551 dan serta air minum berupa aquabides Universitas Sumatera Utara 3. Buah pepaya lokal yang matang untuk bahan pembuatan jus buah pepaya. 3.10 Rancangan Penelitian 3.10.1 Persiapan Hewan Percobaan. Tikus dipelihara dalam kandang plastik dengan anyaman kawat sebagai penutup. Kandang ditempatkan dalam ruangan yang memiliki ventilasi dan mendapat cahaya matahari secara tak langsung. Kandang, tempat makan dan minum dibersihkan sedikitnya tiga kali dalam seminggu. Sebelum perlakuan, tikus diaklitimasi selama satu minggu. Pemberian makan dan minum dilakukan setiap hari secara ad libitum. Pakan yang diberikan berupa pakan tikus standar CP 551 serta air minum aquades. Sampel yang terdiri dari 25 ekor tikus jantan dibagi secara acak dalam 5 kelompok masing-masing 5 ekor tiap kelompok. Setiap kelompok diberi kode kelompok I, II, III, IV, V. Perlakuan diberikan sesuai dengan kelompoknya. Sebelum perlakuan dilakukan penimbangan berat badan sebagai data dasar. Bahan uji diberikan secara oral dengan menggunakan sonde yaitu alat suntik dengan jarum yang ujungnya ditumpulkan. Sonde dimasukkan dengan hati-hati sampai kira-kira mencapai lambung. Waktu pemberian bahan uji diusahakan tetap antara pukul 09.00 WIB-sampai dengan pukul 10.00 WIB. Volume pemberian bahan uji adalah sesuai dosis yang telah diperhitungkan. Universitas Sumatera Utara

3.10.2 Perhitungan Dosis Perlakuan

Dosis jus buah pepaya adalah dosis tunggal 2,6 grml setiap tikus setiap hari. Dosis ini Menurut Sri 2006 bahwa kebutuhan manusia akan buah pepaya per hari adalah sebanyak 100 gram. Kusumawati 2004 menyatakan bahwa faktor konversi dari manusia ke tikus dengan berat badan untuk manusia 70 kg dan berat badan tikus wistar 200 gram adalah 0,026. Jadi 100 g x 0,026 = 2,6 g. Jus buah pepaya diberikan melalui sonde lambung sekali setiap hari. Skala nominal, dengan nilai 1 jika diberi diet jus buah pepaya dan 0 jika tidak diberi jus buah papaya. Variasi pemberian jus pepaya pada kelompok kontrol dan perlakuan adalah dosis 2,6 grekorhari hasil konversi dosis pada manusia diberikan selama 2 minggu dan 4 minggu diberikan melalui sonde lambung.

3.10.3 Persiapan Pakan Standar

Pakan standar menggunakan pakan standar berdasarkan diet untuk rodentia dari CP 551. Ransum pakan standar adalah makanan bagi semua tikus selama penelitian. Pakan standar diberikan selama satu minggu adaptasi hewan percobaan.

3.10.4 Persiapan Diet Kuning Telur

Pembuatan diet kuning telur dilakukan dengan cara; 1 pisahkan kuning telur dari putih telur, 2 kocok kuning telur perlahan untuk mendapatkan Universitas Sumatera Utara emulsinya. Pemberian kuning telur 5 gram 200 gr BB dilakukan pada semua tikus kecuali kelompok kontrol negatif dan mulai hari kedelapan sampai dengan hari terakhir perlakuan, sebelum didekapitasi Prasetyo A et al,2004; Fadhilah A, Prasetyo A,2001; Sampurno A, 2003.

3.10.5 Pembagian Kelompok dan Pemberian Perlakuan

Pada hari ke-8, setelah masa aklitimasi selama 1 minggu,kemudian dibagi secara random sederhana dilakukan pembagian menjadi 5 kelompok yang masing-masing terdiri atas minimal lima ekor tikus dan masing-masing kelompok diberi perlakuan yang berbeda, sebagai berikut : a. Kelompok I atau K1 kelompok kontrol negatif, adalah kelompok sample yang hanya diberi diet standar selama 2 minggu kemudian diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterol total-nya kemudian didekapitasi di hari ke 15, untuk melihat gambaran histopatologis aorta abdominalisnya yang dianggap sebagai gambaran histopatologis aorta abdominalis yang normal. b. Kelompok II atau K2 kelompok kontrol positif, diberi pakan standar dan diet kuning telur saja selama dua minggu kemudian diberi diet standar selama dua minggu lalu di hari ke-29 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis aorta abdominalisnya yang dianggap sebagai gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis. Universitas Sumatera Utara c. Kelompok III atau P1 kelompok perlakuan 1, diberi pakan standar dan diet kuning telur selama dua minggu kemudian diberi diet standar dan jus buah pepaya selama dua minggu berikutnya, lalu di hari ke-29 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis kelompok kontrol perlakuan 1. d. Kelompok IV atau P2 kelompok perlakuan 2, diberi pakan standar dan diet tinggi kolesterol selama dua minggu kemudian diberi diet standar dan jus buah pepaya selama empat minggu berikutnya,lalu di hari ke-43 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis kelompok kontrol perlakuan 2. e. Kelompok V atau P3 kelompok perlakuan 3, diberi pakan standar dan diet kuning telur selama dua minggu kemudian diberi diet standar dan jus buah pepaya selama 8 minggu dan di hari ke-57 diambil sampel darah venanya untuk mengukur kadar LDL dan kadar kolesterolnya kemudian didekapitasi untuk melihat gambaran histopatologis lesi fatty streak aorta abdominalis kelompok kontrol perlakuan 3.

3.10.6 Pemberian jus Buah Pepaya

Jus buah pepaya dibuat dengan menggunakan alat juicer dari bahan daging buah papaya yang diblender menjadi sangat halus kemudian di saring dan Universitas Sumatera Utara ditampung setelah itu diberikan ke sampel percobaan sesuai dosis yang telah ditentukan sekali dalam sehari dengan menggunakan sonde lambung.

3.10.7 Penghitungan Jumlah Sel Busa

Penghitungan jumlah sel busa dilakukan dengan menghitung dari irisan penampang melintang aorta abdominalis yang diproses dan dipulas dengan pewarnaan Hematoksilin-Eosin. Pewarnaan HE dilakukan dengan cara sebagai berikut; 1 sisa jaringan aorta abdominalis difiksasi dalam larutan formalin buffer 10 selama 18 – 24 jam, lalu dimasukkan ke dalam larutan aquades selama 1 jam untuk menghilangkan larutan fiksasi, 2 jaringan didehidrasi dengan larutan alkohol bertingkat dari konsetrasi 30, 50, 70, 80, 90 sampai alkohol absolut, 3 jaringan dimasukan ke dalam larutan alkohol-xylol selama 1 jam, diteruskan ke larutan xylol murni selama dua kali dua jam, 4 jaringan diimpregnasi dengan paraffin cair histoplast selama dua kali dua jam, 5 embedding jaringan dilakukan ke dalam blok, 6 jaringan dipotong dalam blok parafin dengan mikrotom, setebal 4 mikron, 7 irisan potong beku diletakan pada kaca obyek yang sebelumnya telah diolesi poly-l-lisin, pencairan dan pembuangan parafin dari irisan jaringan dilakukan dengan pemanasan dalam inkubator, 8 kemudian dilakukan deparafinasi, 9 setelah bersih, dilakukan pemulasan dengan pewarnaan rutin HE, dan setelah kering diberi balsam Canada dan ditutup dengan kaca penutup. Sel busa dilihat di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 1000 X dan hitung jumlah sel busa di tunika intima dan tunika media pada penampang melintang aorta. Universitas Sumatera Utara

3.10.8 Pengukuran Ketebalan Dinding Aorta Abdominalis

Pengukuran ketebalan dinding aorta abdominalis dilakukan dengan cara yang sama seperti pada proses penghitungan jumlah sel busa, sebagai berikut; 1 tikus didekapitasi dan diambil aorta abdominalis sepanjang 5 cm, 2 jaringan aorta abdominalis difiksasi dalam larutan formalin buffer 10 selama 18 – 24 jam, lalu dimasukkan kedalam larutan aquades selama 1 jam untuk menghilangkan larutan fiksasi, 3 jaringan didehidrasi dengan larutan alkohol bertingkat dari konsetrasi 30, 50, 70, 80, 90 sampai alkohol absolut, 4 jaringan dimasukan ke dalam larutan alkohol-xylol selama 1 jam, diteruskan ke larutan xylol murni selama dua kali dua jam, 5 jaringan diimpregnasi dengan paraffin cair histoplast selama dua kali dua jam, 6 embedding jaringan dalam blok parafin, 7 jaringan dipotong dalam blok parafin dengan mikrotom setebal 4 mikron. 8 irisan potong beku diletakan pada kaca obyek yang sebelumnya telah diolesi poly-l-lisin. Pencairan dan pembuangan parafin dari irisan jaringan dilakukan dengan pemanasan dalam inkubator, 9 dilakukan deparafinasi, 10 setelah bersih dilakukan pemulasan dengan pewarnaan rutin HE, setelah selesai beri balsam Canada dan ditutup dengan kaca penutup, 11 ketebalan aorta abdominalis diukur di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 400 X, 12 ketebalan dinding aorta diukur dari tunika intima sampai adventitia pada delapan zona yaitu zona jam 12.00, 13.30, 15.00, 16.30, 18.00, 19.30, 21.00, 22.30, 13 cara penghitungannya adalah jumlah skala rerata pengukuran delapan zona : 400 X 1000 mikron, atau jumlah rata-rata skala pengukran delapan zona X 2,5 mikron. Universitas Sumatera Utara 3.11 Cara Pengolahan Data 3.11.1 Cara Pengumpulan Data Penghitungan jumlah sel busa dan ketebalan dinding aorta dilakukan melalui adjustment dengan ahli patologi anatomi. Data yang dikumpulkan adalah data yang diambil dengan pemeriksaan secara blind dan diambil reratanya. Data yang dikumpulkan adalah jumlah sel busa dan ukuran ketebalan dinding aorta abdominalis.

3.11.2 Analisis Data

Pada akhir penelitian dilakukan analisis data secara kuantitatif meliputi analisis statistik deskriptif dan analisis statistik inferensial. Data yang ada disunting, ditabulasikan, dibersihkan cleaning, kemudian di analisis. Analisis deskriptif disajikan dalam bentuk grafik dan gambar. Kemudian dilanjutkan dengan uji normalitas Shapiro Wilk n50. Jika distribusi data normal, sehingga menggunakan uji statistic parametric. Uji komparatif pada 2 kelompok perlakuan yang tidak berpasangan adalah dengan One way Anova, namun jika data tidak normal maka dilakukan alternatif uji nonparametric Kruskal-Wallis, dengan tingkat kepercayaan 5. Analisis menggunakan fasilitas pengolah dan penyaji data Statistical product and Service Solution SPSS for windows Dahlan 2011 Universitas Sumatera Utara

3.11.2.1. Analisa Statistik Deskriptif

Analisa statistik deskriptif dengan menggunakan program olah data SPSS, data-data variable yang diukur dari masing-masing kelompok variable dideskripsikan dalam bentuk tabel dan diagram boxplot. Tabel memberikan gambaran data deskriptif: mean, median dan standar deviasi; sedangkan diagram boxplot memberikan gambaran data median, minimal, maksimal, ekstrim dan outline Dahlan ,2004; Santoso, 2004

3.11.2.2 Analisa Statistik Inferensial

Hasil uji parametrik dengan metode analitik untuk sampel n50 menggunakan parameter Shapiro-Wilk. Jika distribusi data tidak semuanya normal maka dilakukan uji nonparametrik Kruskal-Wallis yang merupakan alternatif uji parametriknya One way ANOVA pada uji hipotesis komparatif masing-masing variable Kadar Kolesterol total, jumlah sel busa dan ketebalan dinding aorta abdominal Dahlan, 2012

3.12 Jadwal Penelitian

Keseluruhan lamanya masa penelitian dilaksanakan selama 14 minggu yang dimulai dengan persiapan selama 1 minggu yaitu di minggu awal bulan September 2011, dilanjutkan dengan pelaksanaan penelitian selama 10 minggu yaitu awal bulan Februari 2012 sampai akhir bulan April 2012. Pengumpulan Universitas Sumatera Utara dan analisa data dilaksanakan selama 1 minggu yaitu pada minggu awal bulan April 2013. Penulisan hasil penelitian dilaksanakan selama 2 minggu yaitu pada minggu awal bulan Juli 2013. Universitas Sumatera Utara

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Penelitian

Berdasarkan pengumpulan data dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat digambarkan pada beberapa grafik histogram yang tercantum di bawah ini. Hasildan pembahasan yang didapat pada penelitian ini adalah; 1Kadar kolesterol tikus wistar jantan. 2Kadar LDL tikus wistar jantan.3Jumlah sel busa pada dinding pembuluh darah tikus wistar jantan. 4Tebal dinding pembuluh darah aorta abdominalis tikus wistar jantan.

4.1.1 Kadar Kolesterol Tikus Wistar Jantan

Hasil pengukuran kadar kolesterol tikus wistar jantan ditampilkan pada Lampiran 1, dan gambar 4.1 diperoleh perbedaan rata-rata kadar kolesterol tiap kelompok sampel penelitian.Pada uji normalitas dan homogenitas data, ternyata data tidak berdistribusi normal dan variansinya tidak homogen, sehingga perlu dilakukan transformasi data. Kemudian hasil analisis tetap menunjukkan distribusi data tidak normal dan variansi data yang tidak homogen sehingga tidak memenuhi syarat untuk diuji dengan one way Anova. Oleh karena itu data hanya memenuhi asumsi pengujian data alternatif yaitu uji nonparametrik Krusskal Wallis analisis. Hasil ujinya menunjukkan perbedaan yang nyata antara perlakuan penelitian p0,05. Kemudian dilanjutkan dengan uji Multiple Comparison Post Hoc test – Bonferronidengan hasil sebagai berikut; rata-rata kadar kolesterol tertinggi pada kelompok Kontrol positif 167,4 ± 7,13 mgdl yang diikuti dengan kelompok Universitas Sumatera Utara