40
c. Pembuatan larutan uji. Sebanyak 100,0 mg ekstrak etanolik bunga melinjo ditimbang dan ditambah metanol hingga 25,0 mL. Larutan tersebut diambil sebanyak
1,0; 2,0; 3,0; 4,0; dan 5,0 mL dan ditambah metanol hingga 10 mL, sehingga diperoleh larutan uji 400,0; 800,0; 1200,0; 1600,0; dan 2000,0 µgmL.
6. Skrining fitokimia
a. Uji alkaloida. Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g ditambah 1 mL HCl 2N dan 9 mL akuades, dipanaskan di atas waterbath selama dua menit.
Campuran didinginkan dan disaring. Filtrat kemudian dibagi menjadi tiga: 1 Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk
endapan menggumpal berwarna putih atau kuning yang larut dalam metanol. 2 Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah pereaksi Bouchardat, akan terbentuk
endapan berwarna coklat hingga hitam. 3 Jika terjadi endapan pada kedua percobaan, maka simplisia kemungkinan
mengandung alkaloid. Sebaliknya, jika tidak terjadi endapan pada kedua percobaan, maka simplisia tidak mengandung alkaloid. Filtrat ke-3 digunakan untuk prosedur
berikutnya. Sisa filtrat dikocok dengan 3 mL amonia pekat dan 10 mL campuran eter :
kloroform 3:1. Fase organik diambil, ditambah natrium sulfat anhidrat, dan disaring. Filtrat diuapkan di atas waterbath dan residu yang diperoleh dilarutkan dengan
sedikit HCl 2N. Larutan diuji dengan: a
Asam silikowolframat atau asam fosfomolibdat atau asam foswolframat b
Bouchardat atau Wagner
41
c Mayer atau Dragendorff atau Marme
d Hager
Jika pada pengujian terdapat paling sedikit 2 golongan, maka simplisia positif mengandung alkaloid.
b. Uji saponin. Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah 10 mL akuades panas kemudian didinginkan. Campuran didinginkan
dan dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk buih 1 – 10 cm, tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang pada penambahan HCl 2 N.
c. Uji tanin. Larutan besi III ammonium sulfat 0,5 N diencerkan dengan aquades 5 kali volume awal. Larutan tersebut diteteskan pada cuplikan simplisia.
Tanin positif ditandai dengan warna hijau atau biru sampai hitam. Pengujian senyawa tanin pada ekstrak etanolik bunga melinjo dilakukan dengan mereaksikan ekstrak
etanolik bunga melinjo dengan larutan : 1
Larutan Besi III Klorida 1, hasil positif diketahui dengan terbentuknya warna hijau kehitaman atau biru tua.
2 Larutan gelatin 1, hasil positif ditunjukkan dengan adanya endapan
berwarna putih. 3
Untuk membedakan golongan senyawa tanin dilakukan dengan menambahkan ekstrak etanolik bunga melinjo dengan formaldehid 3 :
asam klorida 2:1, dan dipanaskan dengan waterbath pada suhu 90 C.
Jika terbentuk endapan merah muda maka merupakan tanin katekol tanin terkondensasi. Filtrat dipisahkan dengan cara disaring dan
42
dijenuhkan dengan Na-asetat dan ditambah Besi III Klorida 1, adanya tanin galat tanin terhidrolisis ditunjukkan dengan terbentuknya
warna biru tinta atau hitam. d. Uji triterpenoid dan steroid. Serbuk simplisia diekstraksi dengan etanol
70, kemudian difiltrasi. Filtrat yang didapatkan kemudian dievaporasi hingga kering untuk kemudian diekstraksi kembali dengan kloroform. Hasilnya ditambah
asam asetat anhidrat dan dilanjutkan dengan asam sulfat pekat. Steroid positif ditandai dengan terbentuknya cincin ungu hingga biru pada batas kedua cairan.
e. Uji flavonoid. Sebanyak 0,5 g serbuk diekstraksi dengan 10 mL metanol, menggunakan alat pendingin balik selama 10 menit. Cairan panas disaring
menggunakan kertas saring berlipat, kemudian filtrat diencerkan dengan 10 mL aquades. Setelah dingin, larutan ditambah 5 mL eter minyak tanah, dikocok hati-hati,
dan didiamkan. Lapisan metanol diambil, diuapkan pada suhu 40°C di bawah tekanan. Residu hasil evaporasi dilarutkan dalam 5 mL etil asetat dan disaring untuk
mendapatkan larutan percobaan. Larutan percobaan kemudian dibagi menjadi 3 bagian :
1 Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan hingga kering, residu sisa
penguapan dilarutkan dalam 1-2 mL etanol 95, kemudian ditambahkan 0,5 g serbuk seng Zn P, dan 2 mL HCl 2N, diamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10
tetes HCl pekat, jika dalam waktu 2-5 menit terjadi warna merah intensif maka menunjukkan adanya flavonoid glikosida-3-flavonoid.
43
2 Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan diatas waterbath hingga kering,
residunya dilarutkan dalam 1 mL etanol 95, kemudian ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 10 tetes HCl pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah
ungu menunjukkan flavonoid positif. Jika terjadi warna kuning jingga, menunjukkan adanya flavon, kalkon, dan auron.
3 Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan hingga kering, residu hasil
penguapan kemudian dibasahi dengan aseton P, kemudian ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P, dan serbuk halus asam oksalat P, campuran kemudian
dipanaskan dengan hati-hati diatas waterbath dan hindari pemanasan yang berlebihan. Campurkan sisa yang diperoleh dengan 10 mL eter P. Amati dibawah
sinar UV 366 nm, Jika larutan berfluorosensi kuning intensif, maka menunjukkan adanya flavonoid.
7. Uji kualitatif DPPH dengan kromatografi lapis tipis
