23
4 Tebal larutan
Jika digunakan kuvet dengan tebal yang berbeda maka akan memberikan spektrum serapan yang berbeda.
5 Lebar celah
Makin lebar celah slit width, maka semakin lebar pula serapan band width dimana cahaya semakin polikromatis sehingga resolusi dan puncak-puncak kurva
tidak sempurna.
D. Metode 1,1-Dyphenyl-2-Pycrylhydrazyl DPPH
Metode 1,1-Difenil-2-Pikrilhidrazil DPPH merupakan metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan tanaman obat Shivaprasad et
al., 2005. Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, sensitif, dan reprodusibel untuk pengujian aktivitas antioksidan Savatovic et al, 2012. Tujuan
dari metode ini adalah untuk mengetahui parameter konsentrasi yang ekuivalen memberikan 50 efek aktivitas antioksidan IC
50
Molyneux, 2004 Radikal DPPH merupakan suatu senyawa organik yang mengandung
nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada λ max 517 nm dan berwarna ungu gelap Molyneuk,2003. Prinsip dari metode DPPH adalah reduksi larutan metanolik
radikal bebas berwarna DPPH dengan cara penangkapan radikal bebas Shivaprasad et al., 2005. Adanya elektron yang tidak berpasangan dari DPPH memberikan
serapan kuat pada 517 nm. Ketika elektronnya menjadi berpasangan oleh keberadaan penangkap radikal bebas senyawa antioksidan, maka absorbansinya akan menurun
24
secara stokiometri sesuai jumlah elektron yang diambil. Keberadaan senyawa antioksidan dapat mengubah warna larutan DPPH dari ungu menjadi kuning
Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, and Mohammad, 2009. Penurunan intensitas warna yang terjadi disebabkan oleh berkurangnya
ikatan rangkap terkonjugasi pada DPPH. Hal ini dapat terjadi apabila adanya penangkapan satu elektron oleh zat antioksidan, menyebabkan tidak adanya
kesempatan bagi elektron tersebut untuk beresonansi. Perubahan absorbansi yang terjadi akibat reaksi ini telah digunakan secara luas untuk menguji kemampuan
beberapa molekul sebagai penangkap radikal bebas Dinis, 1994.
Gambar 2. Perubahan warna larutan pada reaksi radikal DPPH dengan Antioksidan Witt, Lalk, Hager, dan Voigt, 2010
Menurut Arianto cit Armala 2009, tingat kekuatan antioksidan senyawa uji dengan menggunakan metode DPPH dapat digolongkan berdasarkan nilai IC
50
dinyatakan dalam tabel III.
25
Tabel III. Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan Metode DPPH
Intensitas nilai
IC
50
Sangat Kuat 50 µgMl Kuat
50 -100 µ gmL Sedang
101 – 150 µgmL Lemah
150 µ gmL Pengujian antioksidan secara kualitatif dengan metode DPPH dilakukan
secara kromatografi lapis tipis. Zat yang telah terelusi disemprot dengan reagen DPPH 0,4 mM dalam metanol untuk mendeteksi ada tidaknya senyawa antioksidan
Masoko and Eloff, 2007. Berdasarkan beberapa sumber acuan, panjang gelombang yang dapat
digunakan sebagai working wavelength adalah 515-520 nm. Waktu Operating Time OT yang optimal adalah 30 menit, namun pada beberapa substrat yang berbeda
dapat digunakan waktu yang lebih singkat 5 atau 10 menit Molyneux, 2004.
E. Ekstraksi
