80
konsentrasi. Scanning dilakukan pada panjang gelombang 400-600 nm. Digunakan
larutan kontrol, tanpa penambahan larutan sampel bertujuan untuk mendapatkan serapan DPPH saja tanpa adanya gangguan serapan dari senyawa-senyawa dalam
sampel.
Tabel VIII. Hasil scanning panjang gelombang maksimum DPPH
Konsentrasi larutan DPPH
Panjang gelombang χ maksimum
hasil scanning Panjang gelombang
χ maksimum yang digunakan
Panjang gelombang
χ maksimum
teoretis 0,016 mM
516 nm 515,5 nm
517 nm 0,048 mM
515,5 nm 0,080 mM
514,5 nm Hasil scanning panjang gelombang pada tiga tingkatan konsentrasi disajikan
dalam tabel VIII. Hasil yang didapatkan ini berbeda dengan panjang gelombang teoretis DPPH yaitu 517 nm. Panjang gelombang maksimum yang digunakan dalam
penelitian ini adalah 515,5 nm, panjang gelombang ini masih diperbolehkan sesuai dengan ketentuan yang tercantum dalam Farmakope Indonesia IV 1995, dimana
batas pergeseran yang diperkenankan adalah maksimum sebesar 2 nm. Oleh karena itu, panjang gelombang maksimum yang digunakan pada penelitian ini adalah 515,5
nm masih memenuhi kriteria.
4. Hasil validasi metode analisis pengujian aktivitas antioksidan
Validasi metode analisis merupakan penilaian terhaap parameter tertentu berdasarkan percobaan di laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan yang digunakan Harmita, 2004. Validitas atau kesahihan metode analisis bertujuan untuk membuktikan metode analisis tersebut secara taat
81
asas dapat memberikan hasil seperti yang diharapkan. Metode yang valid atau tervalidasi akan menjamin hasil yang didapat dari percobaan ini dan memberikan
hasil dengan kecermatan dan ketelitian yang memadai dengan menggunakan instrumen yang tepat, sehingga mampu mengantisipasi permasalahan-permasalahan
analisis yang mungkin timbul. Parameter-parameter yang digunakan dalam validasi metode analisis dalam penelitian ini adalah akurasi, presisi, linearitas, dan
spesifisitas. Validasi analisis ini dilakukan melalui tiga kali pengerjaan. Untuk analisis
validasinya, digunakan data dari ketiga pengerjaan yang paling baik. Karena itu, perlu dibuat persamaan regresi linear antara konsentrasi sampel dalam hal ini rutin dan
ekstrak etanolik bunga melinjo, dengan absorbansi yang diperoleh dari reaksi dengan radikal DPPH, untuk melihat data mana yang memberikan hasil yang paling baik
untuk analisis validasi metode.
Tabel IX. Hasil pengukuran absorbansi seri baku rutin yang sudah direaksikan dengan radikal DPPH
Replikasi I Replikasi II
Replikasi III Konsentrasi
rutin µ gmL Absorbansi
Konsentrasi rutin µ gmL
Absorbansi Konsentrasi
rutin µgmL Absorbansi
2,5 0,681
2,5 0,681
2,4 0,680
5,0 0,556
5,0 0,554
4,8 0,554
7,5 0,433
7,5 0,437
7,2 0,435
10 0,315
10 0,313
9,6 0,314
12,5 0,201
12,5 0,200
12 0,200
Persamaan regresi linear A = 0,7975
B = -0,04804 r = -0,99982
y = 0,7975-0,04804x Persamaan regresi linear
A= 0,7979 B = -0,04812
r = 0,99983 y = 0,7979 -0,0481x
Persamaan regresi linear A = 0,7966
B = -0,05 r = 0,99986
y = 0,7966-0,05x
82
Berdasarkan hasil perhitungan regresi linear yang disajikan pada tabel IX, dipilih satu persamaan yang memiliki nilai r paling mendekati 1 atau -1 sebagai data
yang paling baik. Data ini akan digunakan untuk menghitung akurasi dan presisi dalam validasi metode analisis yang akan dilakukan. Dari ketiga replikasi, persamaan
replikasi tiga yaitu y = 0,7966-0,05x, yang akan digunakan dalam analisis presisi nilai Coefficient of variation dan akurasi nilai recovery seri baku rutin karena
memiliki nilai r yang paling mendekati 1.
Tabel X. Hasil pengukuran absorbansi seri ekstrak etanolik bunga melinjo yang sudah direaksikan dengan radikal DPPH
Replikasi I Replikasi II
Replikasi III Konsentrasi
ekstrak µ gmL
Absorbansi Konsentrasi
ekstrak µgmL
Absorbansi Konsentrasi
ekstrak µ gmL
Absorbansi 80,08
0,702 80
0,703 80
0,701 160, 16
0,568 160
0,567 160
0,566 240,24
0,476 240
0,475 240
0,476 320,32
0,357 320
0,361 320
0,352 400,4
0,240 400
0,244 400
0,242 Persamaan regresi linear
A = 0,8091 B = -0,00142
r = -0,99883 y = 0,8091-0,00142x
Persamaan regresi linear A= 0,8072
B = -0,001405 r = 0,9986
y = 0,8072 -0,00141x Persamaan regresi linear
A = 0,807 B = -0,00142
r = 0,9986 y = 0,807-0,00142x
Berdasarkan hasil regresi linear dari ketiga replikasi yang disajikan dalam tabel X, terlihat bahwa persamaan replikasi satu yaitu y = 0,8091-0,00142x
merupakan data yang paling baik karena memiliki nilai r yang mendekati 1 sehingga dapat digunakan untuk menghitung presisi dan akurasi pada validasi metode analisis.
Persamaan-persamaan yang telah didapatkan tersebut digunakan untuk menghitung konsentrasi terukur baik untuk rutin maupun larutan uji ekstrak etanolik
bunga melinjo. Hasil recovery dan CV dapat dihitung jika konsentrasi tersebut
83
telah didapatkan. Gambar 19 dan 20 berikut menunjukkan kurva persamaan regresi linear anara konsentrasi rutin dan ekstrak etanolik bunga melinjo dengan aktivitas
antioksidannya.
Gambar 19. Kurva regresi linear rutin dengan aktivitas antioksidannya menggunakan metode DPPH
Gambar 20. Kurva regresi linear ekstrak etanolik bunga melinjo dengan aktivitas
antioksidannya menggunakan metode DPPH
y = 0,7966 - 0,05x R² = 0,999
10 20
30 40
50 60
70 80
90
5 10
15
A k
ti v
it a
s a
n ti
o k
s id
a n
Konsentrasi µg mL
Kurva Aktivitas Antioksidan Rutin
84
Dari gambar 19 dan 20, tampak bahwa terdapat korelasi antara konsentrasi rutin dan ekstrak etanolik dengan IC yang ditunjukkan dari koefisien korelasi
grafik nilai r yang mendekati nilai satu. Koefisien korelasi tersebut bernilai positif yang berarti bahwa hubungan antara konsentrasi rutin dan ekstrak etanolik bunga
melinjo dengan IC memiliki hubungan yang sebanding. Artinya semakin besar konsentrasi dari rutin maupun ekstrak etanolik bunga melinjo maka semakin besar
IC yang dihasilkan, begitu juga sebaliknya. a.
Akurasi Penilaian akurasi dari suatu metode analisis didasarkan pada nilai perolehan
kembali recovery yang didapatkan dari data hubungan antara konsentrasi larutan pembanding ataupun larutan uji dengan absorbansi yang dihasilkan.
Tabel XI. Hasil Recovery, SD dan CV uji aktivitas antioksidan rutin
Rutin Konsentrasi
Teoretis µgmL
IC Konsentrasi
terukur µ gmL
Recovery SD
CV
Seri 1 2,5
19,03 2,31
92,48 2,702
0,029 2,5
19,03 2,31
92,48 2,4
19,14 2,33
97,17 Seri 2
5,0 33,89
4,81 96,24
2,594 0,026
5,0 34,13
4,85 97,04
4,8 34,13
4,85 101,08
Seri 3 7,5
48,51 7,27
96,96 2,379
0,024 7,5
48,04 7,19
95,89 7,2
48,28 7,23
100,44 Seri 4
10 62,55
9,63 96,32
2,331 0,024
10 62,78
9,67 96,72
9,6 62,66
9,65 100,54
Seri 5 12,5
76,10 11,91
95,30 2,310
0,024 12,5
76,22 11,93
95,46 12
76,22 11,93
99,38
85
Tabel XII. Hasil Recovery, SD dan CV uji aktivitas antioksidan ekstrak etanolik bunga
melinjo
Ekstrak etanolik
Konsentrasi Teoretis
µgmL IC
Konsentrasi terukur
µ gmL Recovery
SD CV
Seri 1 80,08
21,12 75,42
94,19 0,884
0,009380 80
21,01 74,72
93,39 80
21,24 76,13
95,16 Seri 2
160,16 36,180
169,79 106,01
0,494 0,0046
160 36,29
170,49 106,56
160 36,40
171,20 106,99
Seri 3 240,24
46,517 234,58
97,64 0,204
0,0021 240
46,63 235,28
98,03 240
46,52 234,57
97,74 Seri 4
320,32 59,88
318,38 99,39
0,999 0,010
320 59,44
315,56 98,61
320 60,45
321,90 100,59
Seri 5 400,4
73,03 400,78
100,18 0,348
0,0035 400
72,58 397,96
99,49 400
72,01 399,37
99,84 Dari data pada tabel XI dan XII, recovery rutin berada dalam rentang
92,48 - 100,54, sedangkan ekstrak etanolik bunga melinjo berada dalam rentang 93,39 - 106,99. Rentang recovery yang baik untuk rutin dengan kadar sekitar
10 ppm berkisar antara 90-107. Oleh karena itu dapat dikatakan bahwa persyaratan recovery untuk rutin sebagai bahan p.a. telah terpenuhi. Persyaratan
recovery untuk ekstrak etanolik bunga melinjo sebagai bahan alam juga terpenuhi. Rentang recovery yang baik untuk bahan alam berkisar antara 80 - 120. Dengan
demikian dapat disimpulkan bahwa metode ini memiliki akurasi yang baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
86
b. Presisi
Penilaian presisi dari suatu metode analisis didasarkan pada nilai CV dari data hubungan antara seri konsentrasi rutin dan fraksi air dengan aktivitas antioksidan
yang dihasilkan. Dari data pada tabel XI dan XII, CV rutin berada dalam rentang 0,024 - 0,029 . Persyaratan CV untuk rutin sebagai bahan p.a. terpenuhi, yaitu
untuk kadar sekitar 10 ppm rentang CV yang baik harus ≤ 5. Sedangkan untuk
ekstrak etanolik bunga melinjo CV berada pada rentang 0,0021 - 0,01. Persyaratan CV untuk ekstrak etanolik bunga melinjo sebagai bahan alam juga
terpenuhi, yaitu untuk kadar analit antara 80-400,4 µgmL, nilai presisi yang masih dapat diterima adalah
≤ 5 Harmita, 2004. Metode ini memiliki presisi yang baik karena memenuhi persyaratan yang telah ditetapkan.
c. Linearitas
Linearitas merupakan kemampuan suatu metode untuk dapat menghasilkan hasil uji yang secara langsung proporsional dengan konsentrasi analit dalam sampel.
Linearitas suatu metode didasarkan pada nilai koefisien korelasi r yang dihasilkan dari suatu persamaan regresi linear. Semakin nilai r mendekati ± 1 maka linearitasnya
semakin baik. Nilai koefisien korelasi r untuk larutan pembanding rutin adalah sebesar; replikasi 1 = 0,99982, replikasi 2 = 0,99983, dan replikasi 3 = 0,99986. Dari
ketiga replikasi yang dilakukan, nilai r pada replikasi 3 memiliki nilai koefisien relasi yang paling baik yang digunakan dalam metode analisis. Menurut Mulja dan Hanwar
2003, nilai r yang memenuhi persyaratan linearitas yang baik adalah lebih besar dari 0,999, sehingga nilai r yang dihasilkan dalam penelitian ini masih dapat diterima
87
karena masih berada di atas nilai r yang dipersyaratkan. Hal ini menunjukkan bahwa metode yang digunakan dalam penelitian aktivitas antioksidan rutin ini memiliki
linearitas yang baik untuk pengukuran DPPH. Dari hasil pengujian pada ekstrak etanolik bunga melinjo, didapatkan nilai r
pada replikasi 1 = 0,99883, replikasi 2 = 0, 9986, dan replikasi 3 = 0,9986. Dari tiga replikasi yang dilakukan, hasil terbaik didapatkan pada replikasi satu karena memiliki
nilai r yang paling mendekati satu. Persyaratan linearitas untuk larutan uji mengacu kepada nilai r tabel untuk taraf kepercayaan 95 dan degree of freedom df 3, yakni
0,878 Muth, 1999. Dari hasil tersebut, persamaan kurva baku untuk ketiga replikasi larutan uji telah memenuhi persyaratan linearitas yang baik. Dari hasil yang diperoleh
dapat disimpulkan bahwa metode DPPH yang digunakan pada penelitian ini memiliki linearitas yang baik.
d. Spesifisitas
Spesifitas suatu metode analisis merupakan kemampuan dari suatu metode analisis untuk mengukur analit dalam sampel secara tepat dan spesifik. Pada uji
aktivitas antioksidan
ini, pengukuran
dilakukan dengan
menggunakan spektrofotometri visibel, sehingga spesifikasi metode dapat dilihat dari ada tidaknya
serapan dari sampel sebelum ditambah DPPH pada panjang gelombang pengukuran yaitu 515,5 nm. Adanya serapan dari sampel akan mempengaruhi hasil pengukuran
karena absorbansi yang terbaca adalah absorbansi DPPH dan juga sampel. Spesifisitas uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH dapat dilihat dari
spektra pelarut metanol, senyawa uji, maupun senyawa pembanding rutin yang tidak
88
memberikan serapan pada panjang gelombang maksimum larutan DPPH yang akan diukur absorbansinya sehingga nilai absorbansi yang terukur merupakan absorbansi
larutan DPPH tanpa ada intervensi absorbansi pelarut maupun senyawa lain yang ditambahkan. Berdasarkan hasil scanning pada larutan pembanding rutin dan larutan
sampel uji ekstrak etanolik bunga melinjo lampiran 8c dan 8d pada panjang gelombang 515,5 nm, tidak terdapat serapan sehingga ketika rutin dan sampel uji
direaksikan dengan radikal DPPH maka yang terbaca hanya absorbansi DPPH saja. Oleh karena itu, dapat disimpulkan bahwa metode uji aktivitas antioksidan pada
penelitian ini memiliki spesifitas yang baik.
5. Hasil uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
