43
2 Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan diatas waterbath hingga kering,
residunya dilarutkan dalam 1 mL etanol 95, kemudian ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 10 tetes HCl pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah
ungu menunjukkan flavonoid positif. Jika terjadi warna kuning jingga, menunjukkan adanya flavon, kalkon, dan auron.
3 Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan hingga kering, residu hasil
penguapan kemudian dibasahi dengan aseton P, kemudian ditambahkan sedikit serbuk halus asam borat P, dan serbuk halus asam oksalat P, campuran kemudian
dipanaskan dengan hati-hati diatas waterbath dan hindari pemanasan yang berlebihan. Campurkan sisa yang diperoleh dengan 10 mL eter P. Amati dibawah
sinar UV 366 nm, Jika larutan berfluorosensi kuning intensif, maka menunjukkan adanya flavonoid.
7. Uji kualitatif DPPH dengan kromatografi lapis tipis
a. Pembuatan lempeng KLT. Ditimbang sebanyak 1,5 g serbuk selulosaplate. Dilarutkan dalam 3,5 mL aquades1 g bahan. Dilakukan pengadukan
dengan bantuan sttirer hingga serbuk selulosa larut sepenuhnya dalam pelarut. Larutan selulosa yang telah siap dimasukkan ke dalam penggeser plate, dan kemudian
dilakukan penggeseran plate pada lempeng kaca. Lempeng kaca yang sudah dilapisi selulosa dimasukkan ke dalam oven hingga kering dan siap digunakan.
b. Pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanolik bunga melinjo. Sejumlah ekstrak etanolik bunga melinjo 1 dalam etanol, ditotolkan pada pelat KLT dengan
fase diam selulosa menggunakan pipa kapiler. Sebagai pembanding, dilakukan pula
44
penotolan sejumlah larutan rutin pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler. Kemudian, zat yang telah ditotolkan dielusi dalam chamber KLT menggunakan fase
gerak n-butanol:asam asetat glasial:aquades 5:1:4 vv setinggi 10 cm. Setelah elusi selesai, pelat diangkat dan dibiarkan mengering.
Pelat KLT diperiksa dengan lampu UV 254 nm dan 365 nm untuk ditandai bercaknya dan dicatat warnanya. Pelat disemprot dengan larutan DPPH 0,4 mM pada
almari asam. Latar belakang pelat akan berwarna ungu dan warna kuning pada bercak mencerminkan adanya aktivitas antioksidan. Lama tinggal warna kuning menandakan
besarnya aktivitas antioksidan. c. Identifikasi senyawa flavonoid. Sejumlah ekstrak etanolik bunga melinjo
1 dalam etanol, ditotolkan pada pelat KLT dengan fase diam selulosa menggunakan pipa kapiler. Sebagai pembanding, dilakukan pula penotolan sejumlah larutan rutin
pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler. Kemudian, zat yang telah ditotolkan dielusi dalam chamber KLT menggunakan fase gerak n-butanol:asam asetat
glasial:akuades 4:1:5 vv setinggi 10 cm. Setelah elusi selesai, bercak dideteksi dengan pereaksi Alumunium Klorida 1, hasil positif ditandai dengan terbentuknya
warna kuning pada lempeng KLT. d. Identifikasi senyawa tanin. Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan
ekstrak etanolik bunga melinjo 1 dalam etanol, dan larutan pembanding asam tanat 0,5 dalam etanol. Larutan ekstrak etanolik dan larutan pembanding asam tanat
ditotolkan pada jarak 2 cm dari tepi bawah plat KLT dengan menggunakan pipa kapiler kemudian dikeringkan dan dielusi dengan beberapa sistim pelarut beritkut :
45
a. n-butanol : asam asetat glasial : air 4:1:5 dengan pereaksi besi III klorida
1. b.
Metanol : etil asetat 4:1 dengan pereaksi alumunium III klorida 1.
c. Etil asetat : metanol : asam asetat 6 : 14 :1 dengan pereaksi alumunium
klorida 5. Pelat KLT kemudian dielusi dalam chamber kromatografi hingga batas yang
telah ditentukan. Kemudian noda dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 365 nm, serta dideteksi dengan pereaksi semprot yang telah ditentukan.
Noda yang telah terbentuk masing-masing diukur harga Rf nya. Selanjutnya dilakukan penentuan perbandingan larutan pengembang yang paling baik untuk
identifikasi senyawa tanin.
8. Uji kuantitatif DPPH dengan spektrofotometri visibel a. Uji Pendahuluan. Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam
masing-masing tiga tabung reaksi. Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL metanol p.a, larutan pe
mbanding rutin 37,5 μgmL, dan larutan uji 1200,0 μgmL. Selanjutnya, larutan tersebut ditambahkan dengan 3 mL metanol p.a. Larutan tersebut
kemudian divortex selamam 30 detik. Setelah 30 menit, amati warna pada larutan tersebut.
b. Penentuan operating time OT. Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan kedalam masing-masing tiga labu ukur 5 mL, ditambahkan masing-
masing dengan 1 mL larutan pembanding rutin 12,5; 37,5 dan 62,5 μgmL.
Selanjutnya larutan tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas.
46
Larutan tersebut kemudian divortex selama 30 detik. Setelah itu dibaca absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 517 nm selama 1 jam 5;
10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45; 60 menit. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 400; 1200; 20
00 μgmL. c. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum
λ
maks
. Pada tiga labu ukur 5 mL, dimasukkan masing-masing 0,2; 0,6; dan 1,0 mL larutan DPPH.
Ditambahkan larutan tersebut dengan metanol p.a hingga tanda batas sehingga konsentrasi DPPH menjadi 0,016; 0,048; dan 0,080 mM. Larutan tersebut kemudian
divortex selama 30 detik. Diamkan selama OT. Lalu dilakukan scanning λ serapan
maksimum dengan spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 400-600 nm. d. Pengukuran absorbansi kontrol. Sebanyak 1 mL larutan DPPH
dimasukkan dalam labu ukur 5 mL dan ditambah metanol p.a hingga batas tanda. Kemudian larutan tersebut
dibaca absorbansinya pada OT dan λ
maks
. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Pengukuran ini digunakan sebagai kontrol terhadap
pengukuran absorbansi larutan pembanding rutin dan larutan uji.
e. Pengukuran larutan pembanding rutin dan larutan uji. Sebanyak 1 mL larutan DPPH dimasukkan ke dalam masing-masing lima labu ukur 5 mL.
Ditambahkan masing-masing dengan 1 mL larutan pembanding dan uji pada berbagai seri konsentrasi larutan pembanding dan uji yang telah dibuat. Selanjutnya larutan
tersebut ditambahkan dengan metanol p.a hingga tanda batas. Larutan tersebut kemudian divortek selama 30 detik dan diamkan selama OT. Larutan dibaca
47
absorbansinya dengan spektrofotometer visibel pada λ maksimum. Pengerjaan
dilakukan sebanyak 3 kali.
9. Validasi metode DPPH
