Ekstraksi bahan aktif Penelitian tahap kedua

Sampel 500 g Fase n-heksana dikumpulkan dan dipekatkan dan dihitung rendemennya. Ekstrak MeOH setelah partisi n-heksana dipartisi kembali dengan etil asetat, diulang sebanyak 3 kali. Fase etil asetat dikumpulkan dan dipekatkan, lalu dihitung rendemennya. Ekstrak metanol sisa partisi dipekatkan kembali dan dihitung rendemen. Semua ekstrak diuji fitokimia dan uji antioksidan Miyaoka et al. 1998; Ebada et al. 2008. Diagram alir proses ekstraksi bahan aktif tambelo disajikan pada Gambar 8. Gambar 8 Diagram alir proses ekstraksi bahan aktif tambelo Ebada et al. 2008. Ekstrak MeOH Fase n-heksana Ekstrak n-Heksana Dipartisi dengan n-Heksana Fase MeOH Fase MeOH Maserasi 3x24 jam dengan MeOH perbandingan 1:5 Penyaringan Residu Filtrat Evaporasi Ekstrak MeOH Dipartisi dengan etil asetat Fase etil asetat Evaporasi Evaporasi Ekstrak etil asetat Evaporasi

3.3.2.2 Uji fitokimia Departemen Kesehatan RI 1995

a Uji alkaloid Sampel sebanyak 1 gram ekstrak ditambahkan 10 mL metanol dan beberapa tetes amoniak. Fraksi metanol dipisahkan dan diasamkan dengan 10 tetes H 2 SO 4 2M. Fraksi asam diambil kemudian ditambahkan pereaksi Dragendrof, Meyer, dan Wagner. b Uji saponin Sebanyak 50 mg sampel ditambah dietil eter. Residu yang tidak larut dalam dietil eter diambil, dipisahkan dan ditambahkan 5 ml air kemudian dikocok sampai timbul busa yang stabil. c Uji steroidTriterpenoid Sampel sebanyak 1 gram ditambahkan 25 mL etanol 30 dipanaskan 50 o C dan disaring. Filtratnya diuapkan kemudian ditambahkan eter. Lapisan eter yang terbentuk dipipet dan diletakkan papan uji spot plate dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard 3 tetes asam asetat anhidrin dan 1 tetes H 2 SO 4 pekat, selanjutnya diamati warna yang terbentuk, jika terbentuk warna hijau adalah steroid dan warna merah adalah triterpenoid. d Uji Flavonoid Sebanyak 1 gram sampel ditambah metanol 30 sampai terendam kemudian dipanaskan. Filtratnya ditaruh ke dalam spot plate papan uji kemudian ditambahkan H 2 SO 4 pekat, adanya flavonoid ditunjukkan oleh terbentuknya warna merah akibat penambahan H 2 SO 4 . e Uji Tanin Sebanyak 50 mg sampel dilarutkan dalam 5 ml etanol ditambah dengan beberapa tetes pereaksi FeCl 3 1 . Adanya tannin ditunjukan dengan terbentuknya warna hijau, biru atau ungu. f Fenol hidrokuinon pereaksi FeCl 3 Sebanyak 1 g sampel diekstrak dengan 20 ml etanol 70. Larutan yang dihasilkan diambil sebanyak 1 ml kemudian ditambahkan 2 tetes larutan FeCl 3 5. Terbentuknya warna hijau atau hijau biru menunjukkan adanya senyawa fenol dalam bahan.

3.3.2.3 Uji aktivitas antioksidan Yeh dan Cen 1995

Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode perendaman radikal bebas DPPH 1,1-diphenyl-2-picrlhylhydrazyl Yeh dan Cen 1995. Prinsip kerjanya pada sampel mengandung senyawa bersifat antioksidan yang dapat meredam radikal bebas DPPH. Uji ini dilakukan terhadap e kstrak tambelo. Ekstrak dilarutkan dalam metanol dan dibuat dalam berbagai konsentrasi 20, 40, 60, dan 80 ppm, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ekstrak tersebut masing-masing ditambahkan 200 μl larutan DPPH 1mM dalam metanol. Volume dicukupkan sampai 5 mL, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 30 menit. Serapan sampel tersebut diukur pada panjang gelombang 515 nm. Butylated hydroxytoluene BHT dan vitamin super ester C digunakan sebagai kontrol positif, dan untuk pembanding dengan masing-masing kosentrasi 4, 6, 8, dan 10 ppm. Hambatan dihitung dengan rumus. Nilai absorbansi sampel diperoleh persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara kosentrasi sampel dan persentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai kosentrasi dan hambatan ekstrak diplotkan masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan regresi yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a. Persamaan ini digunakan untuk mencari Inhibition Concentration 50 IC 50 dengan memasukkan angka 50 sebagai y sehingga didapatkan nilai x sebagai IC 50 . Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.

3.3.2.4 Fraksinasi senyawa antioksidan

Fraksinasi terhadap ekstrak kasar tambelo dilakukan pada ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi ekstrak terpilih. Metode yang digunakan ada dua macam, yaitu kromatografi lapis tipis KLT dan kromatografi kolom KK. a Kromatografi lapis tipis KLT Pada penelitian ini, pemilihan pelarut untuk fraksinasi dilakukan dengan mencoba beberapa kombinasi untuk mengembangkan spot ekstrak terpilih pada