amino menggunakan HPLC disajikan Gambar 7. Kondisi alat HPLC saat berlangsungnya analisis asam amino:
Temperatur : 27
o
C suhu ruang Jenis kolom
: pico tag 3,9x 150 μm
Kecepatan alir eluen : 1 mlmenit Tekanan
: 3000 psi Fasa gerak
: - Asetoniril 60 - Buffer fosfat 0,1 M
Detektor : UV
Panjang gelombang : 256 nm Derivatisasi
: derivatisasi pre-kolom Tipe injeksi
: on column injection tanpa septum Program
: isokratik kecepatan aliran eluen konstan Kandungan masing-masing asam amino pada bahan dapat dihitung dengan rumus:
Keterangan :
C = kon sentrasi standar asam amino 2,5 μg
FB = faktor pengenceran 133,1 mL BM = bobot molekul dari masing-masing asam amino gmol
3.3.1.4 Analisis asam lemak AOAC 1984
Kandungan asam lemak dapat ditentukan dengan metode gas kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen dari suatu cairan di antara fasa
gerak berupa gas dan fasa diam berupa zat padat atau cairan yang tidak mudah menguap yang melekat pada bahan pendukung inert. Komponen-komponen yang
dipisahkan harus mudah menguap pada suhu pemisahan yang dilakukan, sehingga suhu operasi biasanya lebih tinggi dari suhu kamar dan biasanya dilakukan
derivatisasi untuk contoh yang sulit menguap. Tahapan analisis asam lemak diawali dengan menghidrolisis lemakminyak dalam sampel menjadi asam lemak,
kemudian ditransformasi menjadi bentuk esternya yang bersifat lebih mudah menguap. Transformasi dilakukan dengan cara metilasi sehingga diperoleh metil
ester asam lemak FAME. Metil ester asam lemak FAME ini dianalisis dengan alat kromatografi gas. Identifikasi tiap komponen dilakukan dengan
membandingkan waktu retensinya dengan standar pada kondisi analisis yang sama. Waktu retensi dihitung pada kertas rekorder sebagai jarak dari garis pada
saat muncul puncak pelarut sampai ke tengah puncak komponen yang dipertimbangkan.
Gambar 7 Prosedur analisis asam amino menggunakan HPLC.
Tambelo kering 0,75 Penambahan 5-10 ml HCl 6N
Pemanasan dalam oven pada suhu 100
o
C selama 24 jam Hidrolisat Protein
Penyaringan dengan milipore berukuran 45 mikron
Filtrat hidrolisat Penambahan 30 μL larutan pengering
campuran antara metanol, natrium asetat, dan trietilamim dengan perbandingan 2:2:1
Pengeringan dengan gas N
2
Hidrolisat protein kering Penambahan 30 μL larutan derivatisasi
campuran antara metanol, pikoiotisianat, dan trietilamin dengan perbandingan 3:3:4
Pengenceran dengan buffer asetat sebanyak 200 μL lalu dibiarkan selama 20 menit
Penyaringan dengan milipore berukuran 0,45 mikron
Injeksi ke alat HPLC Kromatogram
a. Preparasi contohd hidrolisis dan esterifikasi Contoh lemak ditimbang sebanyak 20-30 mg, kemudia ditambahkan 1 mL
larutan NaOH 0,5 N ke dalam metanol dan dipanaskan dalam penangas air selama 20 menit. Sebanyak 2 mL BF
3
16 dan 5 mgmL standar internal ditambahkan pada sampel tersebut, lalu dipanaskan lagi selama 20 menit dan selanjutnya
didinginkan. Sampel kemudian ditambahkan 2 mL NaCl jenuh dan 1 mL n-heksana, lalu dikocok dengan baik. Lapisan heksana dipindahkan dengan
bantuan pipet tetes ke dalam tabung yang berisi 0,1 gram Na
2
SO
4
anhidrat, dibiarkan 15 menit. Fasa cair dipisahkan dan selanjutnya diinjeksikan ke
kromatografi gas. b. Analisis komponen asam lemak dengan kromatografi gas
Pelarut sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom. Bila aliran gas pembawa dan sistem pemanasan sempurna, puncak pelarut akan nampak dalam
kurang dari 1 menit. Sebanyak 5 µL campuran standar FAME diinjeksikan setelah pena kembali ke nol baseline. Jika semua puncak sudah keluar,
diinjeksikan 5 µL sampel yang telah dipreparasi A. Waktu retensi dan puncak masing-masing komponen tersebut kemudian diukur. Jika rekorder dilengkapi
dengan integrator, waktu retensi dan luas puncak langsung diperoleh dari integrator dan membandingkan waktu retensinya dengan standar untuk
mendapatkan informasi mengenai jenis dari komponen-komponen dalam contoh. Jumlah dari masing-masing komponen dalam sampel dihitung menggunakan
metode internal standar, dengan cara sebagai berikut :
Keterangan :
C
x
= kosentrasi komponen x C
s
= kosentrasi standar internal A
x
= luas puncak komponen x A
s
= luas puncak standar internal R
= respon detektor terhadap komponen x relatif terhadap standar
Kondisi alat kromatografi gas pada saat dilakukan analisis : 1. Kolom
: cyanopropil methylsil kolom kapiler 2. Dimensi kolom
: p=60m,ø dalam = 0.25 mm, 025 µm film tickness 3. Laju alir n
2
: 20 mlmenit 4. Laju alir h
2
: 30 mlmenit 5. Laju alir udara
: 200 – 250 mlmenit
6. Suhu injektor : 200
o
c 7. Suhu detektor
: 230
o
c 8. Suhu kolom
: program temperatur - Kolom temperatur : awal 190
o
C diam 15 menit akhir 230
o
C diam 20 menit 9. Ratio
: 1 : 8 10. Injeksi volum
: 1 µl 11. Linier velocity
: 20 cm.sec
3.3.1.5 Analisis mineral
Mineral yang dianalisis pada sampel tambelo meliputi mineral kalsium Ca, kalium K, magnesium Mg, besi, Fe, natrium Na, mangan Mn,
klorida Cl, seng Zn, fospat, dan tembaga Cu, dianalisis dengan metode spektrofotometer serapan atom SSA.
a. Analisis mineral kalsium Ca, kalium K, dan seng Zn Yosida et al. 1972. Prinsip penentuan kadar kalsium, kalium dan seng adalah proses pelarutan
sampel dengan asam klorida, kemudian absorbansinya diukur dengan menggunakan SSA. Prosedur analisis mineral kalsium, kalium dan seng adalah
sebagai berikut: Sampel yang telah kering ditimbang sebanyak 1-2 gram, kemudian dihancurkan dan dimasukkan ke dalam gelas piala yang telah dibilas
dengan HCl 1 N. Sampel ditambahkan dengan 25 mL HCl 1 N dan disimpan selama 24 jam. Setelah penyimpanan, sampel dikocok dengan shaker dan
disaring dengan kertas Whatman No.1. 1. Analisis mineral kalsium Ca
Ekstrak sampel dipipet sebanyak 1 mL, ditambahkan 2 mL larutan lantanum oksida dan ditambahkan HCl 1 N sampai volume menjadi 10 mL,
kemudian ditera dengan penambahan akuades sampai volume menjadi 50 mL.
