Tempat dan Waktu Penelitian

2.4 Metode Penelitian

2.4.1 Karakterisasi Substrat Bahan-bahan yang digunakan sebagai substrat dikeringkan terlebih dahulu dan digiling hingga lolos 20 mesh. Karakterisasi substrat dilakukan untuk menganalisis kandungan komponen proksimat dan karakteristik fisik berupa a w , densitas kamba dan water holding capacity. Karakterisasi substrat dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Prosedur analisis terlampir pada Lampiran 1.

2.4.2 Karakterisasi Isolat Bacillus thuringiensis

Parameter pada karakterisasi isolat meliputi kemampuan selulolitik, amilolitik, dan kemampuan dalam pembentukan sel. Isolat yang telah murni ditumbuhkan pada media starch agar dan CMC agar. Pertumbuhan isolat pada starch agar digunakan untuk mengetahui kemampuan amilolitik isolat sedangkan pertumbuhan isolat pada CMC agar digunakan untuk mengetahui kemampuan selulolitik isolat. Media CMC agar dicampur dengan congo red 0.1 0.1 g congo red dalam 100 ml alkohol 96. Isolat kemudian diinkubasikan selama ±48 jam pada suhu ruangan. Isolat pada media starch agar ditetesi dengan iodin. Isolat yang telah ditetesi, didiamkan selama 15 menit, kemudian dicuci menggunakan NaCl 0.2 M dan disimpan dalam suhu ruang 30±2 o C selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan pengukuran diameter zona bening yang terbentuk di sekitar koloni dan diameter koloni. Seleksi dilakukan berdasarkan nisbah zona bening terhadap diameter koloni pada media starch agar atau CMC agar. Nilai indeks potensial IP bakteri dapat dihitung dengan pengukuran zona bening ϕ zona bening yang terbentuk di sekitar koloni dikurangi diameter koloni ϕ koloni dibagi diameter koloni ϕ koloni Madigan dan Martinko 2006. �� = � � � � � − � � � � Kemampuan pembentukan sel dari setiap galur isolat dapat diketahui melalui uji TPC dan VSC. Isolat dari setiap galur akan ditumbuhkan pada media sederhana nutrient broth dan selanjutnya dilakukan pengukuran terhadap TPC dan VSC.Pengamatan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan.

2.4.3 Penyiapan Inokulum

Inokulum atau kultur bibit untuk menginokulasi medium fermentasi disiapkan secara bertahap mengikuti metode Capalbo et al. 2001. Satu lup biakan Bacillus thuringiensis diinokulasikan dalam 50 ml medium nutrient broth NB dan diinkubasikan dalam rotary shaking incubator pada kecepatan 150 rpm, suhu 30 o C selama 15 jam.

2.4.4 Produksi Bioinsektisida

2.4.4.1 Pengaruh Jenis Substrat Sumber Karbon Terhadap Kemampuan Memproduksi Bioinsektisida

Isolat Bacillus thuringiensis ditumbuhkan pada media kultivasi yang merupakan sumber karbon, yaitu fraksi pati iles-iles, onggok, ampas sagu dan kulit kopi, dan sumber nitrogen urea. Penelitian didesain menggunakan rasio CN 7 pada setiap media kultivasi, berdasarkan hasil penelitian Farrera et al. 1998 dan Nelly 2012, serta nilai a w 0.92 Capalbo et al. 2001. Komposisi mineral trace element ditambahkan sesuai dengan metode Dulmage dan Rhodes 1971, seperti tersaji pada Tabel 2.1. Fermentasi dilakukan pada labu erlenmeyer 250 ml, pH awal media 6.8 – 7.2, bobot media 25 g dan diinkubasi selama 96 jam dalam inkubator pada suhu 30 o C Capalbo et al. 2001. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah sel hidup yang dihitung dengan metode TPC total plate count, jumlah spora yang dihitung dengan metode VSC viable spore count dan toksisitas yang dilakukan dengan metode celup daun Abizar dan Prijono 2010 sehingga diperoleh nilai LC 50 , serta susut bobot dan penurunan kadar serat dari substrat. Uji hayati dilakukan untuk mengetahui keefektifan toksisitas bioinsektisida dalam membunuh serangga sasaran. Pada penelitian ini, digunakan dua jenis serangga sasaran, yaitu ulat kubis Croccidolomia binotalis yang digunakan untuk mengetahui keefektifan kristal protein dari Bacillus thuringiensis subsp. aizawai dan Bacillus thuringiensis subsp. berliner dan nyamuk Aedes aegepty yang digunakan untuk mengetahui keefektifan kristal protein dari Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Pengamatan dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Prosedur analisis pra dan pasca kultivasi disajikan pada Lampiran 2. Contoh perhitungan komposisi media fermentasi pada substrat sumber nitrogen disajikan pada Lampiran 3. Tabel 2.1. Komposisi Mineral Komposisi Mineral Konsentrasi CaCO 3 MgSO 4 .7H 2 O MnSO 4 .7H 2 O ZnSO 4 .7H 2 O FeSO 4 .7H 2 O 1.00 gl 3.00 gl 0.02 gl 0.02 gl 0.02 gl Sumber: Dulmage dan Rhodes 1971 Aktivitas insektisida pada bioinsektisida diukur dengan bioasai. Bioasai merupakan salah satu cara untuk menentukan toksisitas bahan aktif yang dihasilkan oleh mikroorganisme. Pengujian bioasai dilakukan terhadap serangga uji sebanyak 10 ekor dan dibiarkan selama 4 hari. Hasil pengujian kemudian dihitung menggunakan program Probit Quant Yamamoto et al. 1983 untuk memperoleh nilai LC 50 . LC 50 hanya menunjukkan potensi relatif produk karena potensi produk bioinsektisida dinyatakan dalam satuan internasional SI dengan cara pengukuran sebagai berikut: