Waktu dan tempat penelitian Bahan Sampling Sirup Penetapan kadar sampel

37

BAB III METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan tempat penelitian

Penelitian dilakukan di laboratorium Penelitian Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara pada bulan Pebruari 2010 sampai Maret 2010. 3.2 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat instrumen KCKT lengkap Shimadzu prominence series dengan pompa LC 20 AD, degasser DGU 20 AS, injektor Rheodyne 7225i, kolom shimpac VP- ODS 4,6 mm x 250 mm, detektor UVVis SPD 20 A, wadah fase gerak, syringe 100 μl SGE, Sonifikator Branson 1510, pompa vakum Gast DOA - P604 – BN, neraca analitik mettler Toledo, membran filter PTFE 0,5 µm dan 0,2, cellulose nitrat membran filter 0,45 µ m, DRS 8000 Diffuse Reflecttance measuring, Spektrofotometer FTIR Shimadzu IR Prestige-21, Shimadzu UV 1800.

3.3 Bahan

Natrium benzoat BPFI, Baku Kalium sorbat, methanol p.a Merck, Kaliumdihidrogenfosfat Merck, Dikaliumhidrogenfosfat Merck, aquabidestilata PT. Ikapharmindo Putramas , sirup RIA, sirup ABC SPECIAL GRADE rasa jeruk, sirup SUN QUICK rasa mangga dan MARJAN rasa melon. Universitas Sumatera Utara 38

3.4 Sampling Sirup

Proses sampling sirup dilakukan secara purposif, artinya tidak semua anggota dalam populasi mempunyai peluang yang sama untuk terpilih menjadi sampel. Pemilihan sampel berdasarkan pertimbangan secara subjektif yaitu pemilihan secara acak Johannes, 1992. Pengambilan sampel pada penelitian ini didasarkan pada informasi yang tertera pada kemasan sirup yang mencantumkan natrium benzoat dan kalium sorbat sebagai pengawet.

3.5 Prosedur penelitian

3.5.1 Uji Identifikasi Baku Natrium benzoat dan Kalium sorbat

Uji identifikasi baku Natrium benzoat dan Kalium sorbat dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer FTIR, yaitu dengan cara : masing-masing ditimbang 10 mg, lalu dicampur dengan 100 mg serbuk KBr dalam lumpang, digerus hingga halus dan homogen, masing-masing campuran tersebut diletakkan pada sampel pan kemudian dipasangkan pada DRS 8000 dan dianalisa pada bilangan gelombang 4000-500 cm -1 .

3.5.2 Pembuatan fase gerak Metanol dan Dapar fosfat 30 :70

3.5.2.1 Pembuatan Dapar Fosfat pH 6,8

Ditimbang kaliumdihidrogenfosfat 680 mg dan dikaliumhidrogenfosfat 870 mg, dimasukkan ke dalam labu tentukur 1000 ml kemudian dilarutkan dan dicukupkan dengan aquabidest sampai garis tanda larutan dapar fosfat pH 6,8 , lalu disaring dengan menggunakan celllulosa nitrat membran filter 0,45 µm, kemudian diawaudarakan ± 20 menit. Universitas Sumatera Utara 39

3.5.2.2 Metanol p.a

Metanol p.a disaring dengan menggunakan membran filter PTFE 0,5 µ m, kemudian diawaudarakan ± 20 menit.

3.5.3 Pembuatan pelarut

Sebanyak 300 ml metanol p.a dimasukkan ke dalam labu tentukur 1000 ml lalu diencerkan dengan larutan dapar fosfat pH 6,8 sampai garis tanda.

3.5.4 Penyiapan alat KCKT

Kolom yang digunakan Shimpac VP-ODS 4.6 mm x 250 mm, dan detektor UV-Vis. Pompa menggunakan mode aliran tetap dengan low-pressure gradient system untuk memperoleh komposisi fase gerak yang konstan selama analisis. Setelah alat KCKT dihidupkan, maka pompa dijalankan dan fase gerak dibiarkan mengalir selama 30 menit sampai diperoleh garis alas yang datar yang menandakan sistem tersebut telah stabil.

3.6 Prosedur Analisis

3.6.1 Penentuan Kondisi Kromatografi untuk Mendapatkan Hasil Analisis yang Optimal

Panjang gelombang analisis ditentukan dengan cara membuat spektrum serapan dari Natrium benzoat dan Kalium sorbat menggunakan spektrofotometer UV. Kemudian spektrum serapan yang diperoleh dibuat overlapping untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa keduanya memberikan serapan maksimum. Pada pengukuran panjang gelombang ini, Natrium benzoat dan Kalium sorbat masing – masing dibuat dengan konsentrasi 4,7 ppm dan 1,85 ppm. Kondisi lainnya yang divariasikan untuk mendapatkan hasil analisis optimum adalah komposisi fase gerak dan laju alir. Perbandingan fase gerak metanol-dapar Universitas Sumatera Utara 40 fosfat yang divariasikan 5:95, 10:90, dan 30:70, sedangkan laju alir divariasikan 0,8 dan 1 mlmenit. Kondisi kromatografi yang memberikan waktu tambat singkat, jumlah lempeng teoritis yang tinggi dan tailing faktor paling kecil selanjutnya dipilih sebagai kondisi yang akan digunakan dalam penelitian ini.

3.6.2 Analisis Kualitatif

Natrium benzoat BPFI dengan konsentrasi 60 ppm dan baku Kalium sorbat dengan konsentrasi 20 ppm disuntikkan ke sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µm pada kondisi yang terpilih. Waktu tambat Natrium benzoat dan Kalium sorbat dibandingkan dengan waktu tambat dari masing-masing sirup.

3.6.3 Pengukuran Sampel

Ditimbang 5 gram sirup, kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 50ml, lalu dilarutkan dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda. Dikocok-kocok ± 5 menit lalu disaring dengan membran filter PTFE 0,2 µm kemudian diawaudarakan selama 15 menit. Masing-masing sampel diinjeksikan sebanyak 6 kali ke sistem KCKT dengan volume penyuntikan 20 µl diukur pada panjang gelombang 230 nm dengan laju aliran 0,8 mlmenit. 3.6.4 Pembuatan Larutan Induk Baku LIB 3.6.4.1 Pembuatan Larutan Induk Baku natrium benzoat Ditimbang seksama 50 mg Natrium benzoat BPFI, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml. Kemudian ditambahkan dengan sedikit pelarut, kocok hingga larut. Setelah larut, diencerkan lagi dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm LIB I. Universitas Sumatera Utara 41 Dari LIB I dipipet 10 ml, lalu dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, kemudian diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 ppm LIB II. 3.6.4.2 Pembuatan Larutan Induk Baku kalium sorbat Ditimbang seksama 50 mg Baku kalium sorbat, dimasukkan ke labu tentukur 50 ml. Kemudian ditambahkan dengan sedikit pelarut, kocok hingga larut. Setelah larut, diencerkan lagi dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 1000 ppm LIB I. Dari LIB I dipipet 10 ml, lalu dimasukkan ke labu tentukur 50 ml, kemudian diencerkan dengan pelarut sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 200 ppm LIB II.

3.6.5 Pembuatan Kurva Kalibrasi Natrium benzoat dan Kalium sorbat

Untuk Kurva kalibrasi, Natrium benzoat dibuat dengan konsentrasi 5, 20, 40, 60 dan 80 ppm, sedangkan Kalium sorbat 1, 10, 20, 40 dan 60 ppm. Tahap-tahap pembuatan larutan campuran Natrium benzoat dan Kalium sorbat dengan konsentrasi di atas adalah sebagai berikut : - Benzoat 5 ppm Sorbat 1 ppm, dibuat dengan memipet 0,5 ml dari LIB II Natrium benzoat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10 ppm larutan A. Kemudian Dipipet 0,5 ml dari LIB II Kalium sorbat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 10 ppm larutan B. Universitas Sumatera Utara 42 Dari larutan A dipipet 5 ml dan dari larutan B dipipet 1 ml lalu dimasukkan ke labu 10 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas. - Benzoat 20 ppm Sorbat 10 ppm, dibuat dengan memipet 5 ml dari LIB II Natrium benzoat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 ppm larutan A. Kemudian Dipipet 5 ml dari LIB II Kalium sorbat lalu dimasukkan ke labu tentukur 10 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 100 ppm larutan B. Dari larutan A dipipet 5 ml dan dari larutan B dipipet 2,5 ml lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas. - Benzoat 40 ppm Sorbat 20 ppm, dibuat dengan memipet 5 ml dari LIB II Natrium benzoat dan 2,5 ml dari LIB II Kalium sorbat, lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas. - Benzoat 60 ppm Sorbat 40 ppm, dibuat dengan memipet 7,5 ml dari LIB II Natrium benzoat dan 5 ml dari LIB II Kalium sorbat, lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas. - Benzoat 80 ppm Sorbat 60 ppm, dibuat dengan memipet 10 ml dari LIB II Natrium benzoat dan 7,5 ml dari LIB II Kalium sorbat, lalu dimasukkan ke labu 25 ml dan dicukupkan dengan pelarut hingga garis batas.

3.7 Penetapan kadar sampel

Kadar Natrium benzoat dan Kalium sorbat X dihitung dengan mensubstitusi luas puncak ke dalam persamaan regresi yang diperoleh dari kurva Universitas Sumatera Utara 43 kalibrasi pada bagian 2.5.4.1 sebagai Y. Hasilnya lalu dikali dengan volume pengenceran 50 ml , kemudian dibagi dengan berat penimbangan sampel sehingga diperoleh kadar Natrium benzoat dan Kalium sorbat dalam sirup dengan satuan mcgg ppm sampel. Rumus perhitungan kadar Natrium benzoat dan Kalium Sorbat dalam sirup dituliskan sebagai berikut : Kadar Natrium benzoat dan Kalium sorbat dalam sirup mcgg sampel : = X mcgml x g berat ml n pengencera 3.8 Validasi Metode 3.8.1 Akurasi