posfat, pyrogallol, coomassie brilliant blue G-250, bovine serum albumin BSA, Triton-X 100, H
2
O
2
, H
2
SO
4
5, buffer tris HCl, nitrogen cair.
3.3 Metode Penelitian a. Penanaman salak
Biji salak yang diperoleh dari desa Sibakua dan Huta Lambung, Padang Sidempuan, Tapanuli Selatan diambil secara random acak sebanyak masing-masing
25 buah yang selanjutnya dibawa ke Laboratorium Genetika, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara,
Medan. Kemudian digerus pada bagian embrio dengan kertas pasir halus. Direndam dalam air selama 1-2 jam. Ditanam dalam polibag yang berukuran 25 cm sedalam 15
cm dengan perbandingan tanah dan pasir 1:1 sampai setengah bagian biji salak tampak di permukaan polibag. Disiram setiap hari agar biji tidak kering. Penanaman
dilakukan selama 6 bulan untuk anakan salak yang berdaun dan berbatang muda serta sudah berakar dan selama 2 bulan untuk kecambah salak.
b. Metode pengujian aktivitas enzim Peroksidase dan Polifenol Oksidase : 1. Ekstraksi Organ Tanaman
Ekstraksi organ tanaman dari kecambah, batang dan daun salak anakan berumur 6 bulan dan kecambah berumur 2 bulan diambil sebanyak 200 mg kemudian
digerus dengan menggunakan nitrogen cair dan dihomogenisasi dengan 2 ml buffer 0,05 M pada pH 8 suhu 0
o
C dan 0,15 Triton-X 100, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 20 menit suhu 0
o
C. Diambil supernatan yang terbentuk
untuk analisis selanjutnya.
2. Determinasi Protein
Kadar protein ditentukan dengan menggunakan 0,1 ml ekstrak kecambah, batang dan daun salak dan dicampur dengan 5ml larutan reagen pewarna protein
coomassie brilliant blue G-250. Campuran dihomogenkan dan diukur absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Ditandai
dengan terjadinya perubahan warna larutan dari warna merah menjadi biru apabila
Universitas Sumatera Utara
terjadi ikatan antara reagan warna protein dengan protein setelah 2 menit hingga 1 jam.
3. Penentuan Aktivitas Enzim
Penentuan aktivitas dari enzim Peroksidase PO dan Polifenoloksidase PO dengan menggunakan metoda Kar and Mishra 1976. Prosedur ini berdasarkan
kenyataan bahwa PO dan PPO dapat mengoksidasi pyrogallol. Proses oksidasi dari PO dalam mengkatalisis reaksi menggunakan H
2
O
2
Kar and Mishra, 1976: Maehly and Chance, 1954, sedangkan oksidasi dari PPO tidak menggunakan H
2
O
2
.
3. 1 Enzim Peroksidase PO
Pengujian aktivitas enzim PO dengan menggunakan 30 μl protein dari batang
dan daun salak dicampur dengan 0,1 ml buffer posfat pada pH 6,8 dan suhu 25
o
C, lalu ditambahkan 10 mM H
2
O
2
sebanyak 0,1 ml, didiamkan selama 5 menit, kemudian ditambahkan 0,5 ml H
2
SO
4
5 vv untuk menghentikan reaksi. Pengukuran kadar purpurogallin dilakukan dengan menggunakan metoda Bausch
Lomb Spectronic 70 Kolorimeter dengan menggunakan spektrofotometer panjang gelombang 420 nm. Campuran reaksi antara buffer posfat dengan pyrogallol
digunakan sebagai larutan blanko.
3. 2 Enzim Polifenoloksidase PPO
Pengujian aktivitas enzim PPO menggunakan prosedur yang sama dengan pengujian enzim peroksidase. Pengujian ini menggunakan penambahan ekstrak
kecambah, batang dan daun salak sebanyak 70 μl protein dan ditambahkan 5 ml
larutan pereaksi yang terdiri dari 0,1 ml buffer posfat pada pH 6,8 dan suhu 25
o
C, didiamkan selama 5 menit, kemudian ditambahkan 0,5 ml H
2
SO
4
5 vv untuk menghentikan reaksi. Larutan diukur nilai absorbansinya pada panjang gelombang
420 nm.
3.3 Pembuatan Kurva Standar Bovine Albumin
