d. Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya, seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu Gandjar dan Rohman, 2007.
H. Metode Uji Antioksidan
Metode DPPH merupakan salah satu metode yang paling sering dilakukan untuk uji aktivitas antioksidan suatu tumbuhan obat. Metode DPPH menggunakan
radikal bebas 2,2 Diphenyl-1-picrylhidrazyl DPPH Shivaprasad, et, al., 2005. DPPH merupakan suatu senyawa radikal nitrogen yang tidak stabil karena memiliki
elektron yang tidak berpasangan yang menyebabkan DPPH memiliki sifat yang reaktif. DPPH akan mengalami reduksi melalui proses donasi hidrogen atau
elektron sehingga warna DPPH dapat mengalami perubahan warna dari ungu menjadi kuning Halliwell dan Gutteridge, 2000.
Metode ini bertujuan untuk mengetahui parameter yang menunjukan aktivitas antioksidan yaitu parameter konsekuensi yang ekuivalen dapat
memberikan efek aktivitas antioksidan sebesar 50 IC
50
. Parameter IC
50
dapat diketahui dengan menginterpretasikan hasil uji dalam suatu data eksperimental
Molyneux, 2004. Radikal DPPH memberikan serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm
dengan warna violet gelap. DPPH dapat memberikan serapan karena memiliki gugus kromofor dan auksokrom pada struktur kimianya dan dengan adanya
delokalisasi elektron pada DPPH akan memberikan warna violet Dehpour, Ebrahimzadeh, dan Nabavi, 2009.
Gambar 1. Struktur DPPH Molyneux, 2004
Gambar 2. Reduksi DPPH oleh senyawa antioksidan Prakash, Rigelhof dan Miller, 2001
Metode deoksi ribosa, disebut juga sebagai hydroxyl radical scavenging assay
merupakan saah satu metode sederhana dalam pengukuran aktivitas antioksidan. Metode deoksiribosa memiliki sensitivitas tinggi dan tidak
memerlukan alat canggih dalam analisisnya. Prinsip dari metode deoksiribosa ini berdasarkan pemecahan oksidatif 2-deoksiribosa oleh senyawa radikal hidroksil
dan hasil dari pemecahan tersebut akan bereaksi dengan asam tiobarbiturat dan menghasilkan warna. Penambahan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan
akan melindungi deoksiribosa dari radikal hidroksil sehingga pembentukan warna menjadi berkurang Haliwell, 1987.
Prinsip dari uji CUPRAC Cupric Reducing Antioxidant Capacity adalah pembentukan kelat oleh bis neukuproin besi II menggunakan pereaksi redoks
kromogenik pada pH 7. Absorbansi dari pembentukan kelat Cu I Ne diperoleh dengan mereaksikan asam askorbat berbagai konsentrasi dengan reagen CUPRAC.
Kondisi reaksi seperti konsentrasi reagen, pH, dan waktu oksidasi pada suhu kamar dan peningkatan suhu pada percobaan dapat berasal dari sumber lain Apak et al,
2005
I. Spektrofotometri visibel
Spektrofotometri visibel merupakan salah satu teknik analisis fisika-kimia yang mengamati tentang atom atau molekul dengan radiasi elektromagnetik pada
panjang gelombang 380-780 nm. Serapan maksimum suatu senyawa kimia dipengaruhi oleh adanya kromofor dan gugus auksokrom. Interaksi antara senyawa
kimia yang memiliki gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik dan spektra serapan elektromagnetik. Tiga hal yang mungkin timbul ketika terjadi interaksi
molekul dengan radiasi elektromagnetik adalah hamburan, absorbsi dan emisi Mulja dan Suharman, 1995.
Terikatnya gugus auksokrom pada gugus kromofor akan meningkatkan absorbansinya dan menggeser puncak serapan ke panjang gelombang yang lebih
panjang. Peningkatan intensitas absorbsi disebut efek hiperkromik. Pergeseran panjang gelombang dibedakan menjadi pergeseran batokromik, yaitu pergeseran
panjang gelombang ke arah yang lebih panjang yang disebabkan karena substitusi
atau pengaruh pelarut, dan pergseran hipsokromik, yaitu pergeseran serapan ke arah panjang gelombang yang lebih pendek yang disebabkan karena substitusi atau
pengaruh pelarut pergeseran biru Sastrohamidjojo, 2001. Hal-hal yang harus diperhatikan dalam analisis spektrofotometri UV-Vis:
1. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis
Hal yang perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah menjadi
senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu. Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan yaitu:
Reaksinya selektif dan sensitif Reaksinya cepat, kuantitatif, dan reprodusibel
Hasil reaksi stabil dalam dalam jangka waktu yang lama Keselektifan dapat dinaikkan dengan mengatur pH, pemakaian masking agent
atau penggunaan teknik ekstraksi Gandjar dan Rohman, 2007. 2.
Waktu Operasional Operating Time Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau
pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan mengukur hubungan antara
waktu pengukuran dengan absorbansi larutan Gandjar dan Rohman, 2007. Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna ini
meningkat sampai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil. Semakin lama pengukuran, maka ada kemungkinan senyawa yang berwarna
tersebut menjadi rusak atau terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya juga turun Gandjar dan Rohman, 2007.
3. Pemilihan Panjang Gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Untuk memilih
panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku pada
konsentrasi tertentu Gandjar dan Rohman, 2007. Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang
maksimal, yaitu: Pada panjang gelombang maksimal, bentuk kurva kepekaannya juga
maksimal karena pada panjang gelombang maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar
Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi
Jika dilakukan pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan
panjang gelombang maksimal Gandjar dan Rohman, 2007. 4.
Pembuatan Kurva Baku Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianalisis dengan berbagai
konsentrasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan berbagai konsentrasi diukur, kemudian dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi
y dengan konsentrasi x. Penyimpangan dari garis lurus biasanya dapat
disebabkan oleh kekuatan ion yang tinggi, perubahan suhu, dan reaksi ikutan yang terjadi Gandjar dan Rohman, 2007.
5. Pembacaan Absorbansi Sampel atau Cuplikan
Absorban yang terbaca hendaknya antara 0,2 - 0,8 atau 15 - 70 jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini ini berdasarkan anggapan bahwa
kesalahan dalam pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5 Gandjar dan Rohman, 2007.
J. Landasan Teori
