34
BAB III METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian.
Penelitian daya antiracun timbal Pb dengan menggunakan Na
2
CaEDTA dilanjutkan ekstrak etanol ketela pohon Manihot utilissima merupakan jenis
penelitian eksperimental murni rancangan acak pola satu arah.
B. Variabel dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas Variabel bebas dalam penelitian ini adalah dosis ekstrak etanol daun ketela pohon
Manihot utilissima Pohl. yaitu 800 mgkg BB dan dosis Na
2
CaEDTA yaitu 189 mgkg BB.
b. Variabel tergantung Variabel tergantung dalam penelitian ini adalah kadar timbal dalam darah setelah
perlakuan. c. Variabel pengacau
1 Variabel pengacau terkendali a. Subyek uji
: tikus putih galur Wistar b. Umur hewan uji
: 1,5-2 bulan c. Jenis kelamin hewan uji
: betina
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
d. Berat badan hewan uji : 100-150 gram
e. Bobot dan jenis pakan : pelet tipe BR2 10 ghariekor f. Air minum hewan uji : aquadest
g. Cara pemberian bahan uji : secara per oral h. Asal bahan uji : kebun obat Merapi Farma, Kaliurang
Pengendalian terhadap variabel di atas bertujuan untuk mengurangi faktor- faktor yang dapat mengganggu hasil penelitian.
2 Variabel pengacau tak terkendali a. Kondisi patologis tikus adalah keadaan individu tikus yang akan
mempengaruhi farmakokinetika timbal baik mekanisme absorpsi, distribusi maupun ekskresi,
2. Definisi operasional
a. Ekstrak etanol adalah ekstrak etanol daun ketela pohon Manihot utillisima Pohl. yang diperoleh dengan metode sokhletasi menggunakan etanol 95.
b. Hewan uji adalah tikus putih galur Wistar dengan jenis kelamin betina. c. Kadar timbal darah praperlakuan adalah kadar timbal yang terkandung dalam
darah hewan uji pada hari ke-0. d. Kadar timbal darah pascaperlakuan adalah kadar timbal darah hewan uji yang
terukur pada hari ke-35 dan ke 40. e. Pemberian ekstrak etanol daun ketela pohon setelah pemberian Na
2
CaEDTA adalah pemberian ekstrak etanol setelah 2 jam pemberian Na
2
CaEDTA.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
C. Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih betina galur Wistar dengan berat
100 - 150 g dan umur 1,5 - 2 bulan Laboratorium Biofarmasetika Fakultas Farmasi USD, serbuk daun ketela pohon kebun obat Merapi Farma, Kaliurang,
Na
2
CaEDTA p.a. Merck, etanol 95 p.a Merck, timbal asetat p.a. Merck, Standar Pb 1000 ppm p.a. Merck, aquadest, larutan saline NaCl 0,9 0,1 N,
HNO
3
65 p.a. Merck , HClO
4
37 p.a. Merck, selulosa p.a. Merck, n-butanol p.a. Merck, asam asetat p.a. Merck, AlCl
3
p.a. Merck, FeCl
3
p.a. Merck, rutin p.a. Sigma.
D. Alat Penelian
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah seperangkat alat gelas Pyrex,
ayakan, sokhlet, kertas saring, oven WTB binder 78352 TuttlingenGermany, bejana pengembang, alat semprot bercak, SpektroskopiUV 254 nm dan 365 nm, neraca
Mettler Toledo, spuit injeksi per oral dan intra muskular, eppendorf, bluetype, yellowtype
, pipet tetes, pipa kapiler tanpa heparin, hot plate Heidolph MR 2002, mikropipet 200 - 1000µl GILSON Z 64581D, Spektroskopi Serapan Atom Hitachi
Z-8000 Polarized Zeeman.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
E. Tata Cara Penelitian
1. Determinasi tanaman
Determinasi dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman daun ketela pohon Manihot utillisima Pohl. dilakukan dengan cara mencocokkan dengan kunci
determinasi pada buku Flora untuk Sekolah di Indonesia.
2. Preparasi bahan
a. Pengumpulan, pengeringan daun ketela pohon dan pembuatan serbuk. Bagian tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah bagian daun
yang telah dikeringkan. Proses penanaman, pengeringan dan pembuatan serbuk daun dilakukan oleh petugas di Merapi Farma Kaliurang.
b. Pembuatan ekstrak etanol daun ketela pohon Ekstrak etanol daun ketela pohon dibuat dengan menimbang 40 gram serbuk
daun ketela pohon lalu dimasukkan ke dalam kantong dari kertas saring. Serbuk daun ketela pohon dalam kantong dimasukkan dalam labu sokhlet kemudian diberi
pelarut etanol sebanyak 2 kali sirkulasi. Proses sokhletasi dilakukan hingga cairan yang terekstraksi mendekati jernih dengan suhu ± 50-60
C. Timbang cawan porselen kering kemudian ekstrak kental dimasukkan ke dalam cawan yang sudah ditara
dilanjutkan penguapan mendekati kering dengan oven pada suhu 50 C Anonim,
1986. Timbang ekstrak kering yang didapat untuk mengetahui rendemen.
100 gram
diekstrak yang
serbuk berat
gram kering
ekstrak berat
Rendemen ×
=
9
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
c. Pembuatan larutan ekstrak etanol daun ketela pohon. Larutan ekstrak 6,4 bv dibuat dengan menimbang lebih kurang 6,4 gram
ekstrak kering daun ketela pohon kemudian dilarutkan dengan aquadest 100 C
sampai 100 ml pada labu ukur 100,0 ml. d. Pembuatan larutan timbal asetat.
Larutan timbal asetat 0,004 bv dibuat dengan menimbang lebih kurang 0,004 gram serbuk timbal asetat kemudian ditambah aquadest 100
C sampai 100 ml pada labu ukur 100,0 ml. Timbal asetat PbCH
3
COO
2
.3H
2
O berupa serbuk berwarna putih. Timbal asetat dilarutkan dalam aquadest 100
C Anonim, 1995b hingga diperoleh konsentrasi larutan timbal asetat 0,04 mgL. Menurut Anonim
2008c, reaksi antara timbal asetat dengan air menghasilkan timbal asetat trihidrat 10.
PbCH
3
COO
2
+ 3 H
2
O PbCH
3
COO
2
. 3H
2
O
10 Aquadest 100
C digunakan untuk melarutkan timbal karena timbal sulit larut dalam air dingin dan air asam, tapi larut dalam asam nitrit, asam asetat dan asam
sulfat pekat. Aquadest merupakan pelarut universal yang sifatnya netral dan tidak beracun.
e. Pembuatan larutan Na
2
CaEDTA. Larutan Na
2
CaEDTA 151,2 bv dibuat dengan menimbang 151,2 gram serbuk Na
2
CaEDTA kemudian ditambah larutan saline NaCl 0,9 0,1 N sampai 100 ml pada labu ukur 100,0 ml.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
3. Uji analisis kualitatif rutin pada daun ketela pohon
Ekstrak kering hasil sokhletasi, ditimbang sebanyak 640 mg lalu ditambahkan etanol 95 hingga volumenya tepat 10 ml.
Fase diam : selulosa
Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air 4 : 1 : 5 vv, fase atas
Deteksi : UV 254 nm; 365 nm; uap amonia; AlCl
3
Pembanding : rutin 0,1 bv
4. Penyiapan hewan uji
Penyiapan hewan uji dilakukan dengan cara sepuluh pasang tikus jantan dan betina dikawinkan sehingga bunting. Setelah dua puluh hari masa organogenesis dan
dilahirkan, anak tikus yang berumur tiga minggu dipisahkan dari induknya. Tikus betina yang berumur 6-8 minggu dipilih sebagai hewan uji.
Persiapan hewan uji dilakukan beberapa bulan sebelum penelitian agar bisa mengendalikan variabel pengacau, seperti asupan makanan dan minuman selalu
dikendalikan dan yang lebih penting lagi umur dari hewan uji benar – benar dapat dipastikan. Dalam penelitian ini asupan makanan yang diberikan adalah pelet tipe
BR2 dengan pemberian 10 ghariekor sedangkan untuk minuman diberi aquadest yang selalu baru setiap harinya.
Hewan uji yang digunakan adalah yang berjenis kelamin betina. Kemudian dipelihara hingga tikus yang dipilih telah siap untuk dijadikan hewan uji dalam
penelitian ini baik dari segi umur dan juga berat badannya. Penge ndalian hewan uji
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
ini diharapkan mapu mengurangi variabel pengacau yng berasal dari hewan uji dan lingkungan.
5. Optimasi lama pemejanan timbal yang mencapai kadar toksik yang
membutuhkan terapi khelasi
Optimasi lama pemejanan ini dilakukan pada 8 ekor tik us. Dosis timbal yang dipejankan adalah 0,5 gkgBBoralharitikus Hariono, 2005. Center for
Disease Control CDC menyarankan penggunaan terapi khelasi jika kadar timbal
dalam darah 0,70 ppm. Menurut Hariono 2005, kadar timbal darah ya ng membutuhkan terapi khelasi dicapai pada hari ke-30 0,75 ppm. Menurut
Wahyunengsih, Fedilia, Astoro, Putri 2007, kadar toksik yang membutuhkan
khelasi dicapai pada hari ke-40. Hasil pengukuran dapat dilihat pada lampiran 8. 6.
Pengelompokan dan perlakuan hewan uji
Hewan uji dibagi menjadi 4 kelompok tiap kelompok terdiri dari 7 ekor
hewan uji.
Kelompok I : kontrol negatif aquadest Kelompok II : kontrol positif timbal
Kelompok III : timbal-Na
2
CaEDTA Kelompok IV : perlakuan timbal-Na
2
CaEDTA dilanjutkan dengan ekstrak etanol daun ketela pohon
Kelompok I merupakan kelompok kontrol negatif. Kontrol negatif adalah larutan pensuspensi yang digunakan untuk melarutkan ekstrak etanol daun ketela
pohon yang akan dipejankan pada hewan uji. Dalam penelitian ini menggunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
aquadest. Pemilihan aquadest dikarenakan senyawa baik timbal maupun rutin mempunyai kelarutan yang baik dalam aquadest. Selain itu, aquadest merupakan
pelarut yang aman bagi hewan uji. Kelompok II merupakan kelompok kontrol timbal. Hewan uji pada
kelompok perlakuan ini dipejankan timbal asetat dengan dosis 0,5 gkgBBhari secara per oral Hariono, 2005 selama 30 hari dengan volume pemberian disesuaikan
dengan berat badan tiap hewan uji. Kelompok III dapat berfungsi sebagai kontrol terhadap kelompok timbal-
Na
2
CaEDTA dilanjutkan pemberian ekstrak etanol daun ketela pohon tetapi juga dapat berfungsi sebagai perlakuan terhadap kontrol negatif dan kontrol positif. Pada
hari ke-31 hingga hari ke-40 diberi antiracun Na
2
CaEDTA. Pemberian Na
2
CaEDTA dengan dosis 189 mgkg BB secara intra muskular Katzung, 2004 dimaksudkan
untuk melihat apakah Na
2
CaEDTA dapat menurunkan kadar timbal dalam darah sesuai dengan literatur.
Kelompok perlakuan IV yaitu kelompok perlakuan timbal-Na
2
CaEDTA dilanjutkan ekstrak etanol daun ketela pohon. Pada kelompok ini, setelah dua jam
pemberian Na
2
CaEDTA hewan uji dipejankan ekstrak etanol daun ketela pohon dengan dosis 800 mgkg BB secara per oral Adimunca, 1998. Pada dosis 800 mgkg
BB secara per oral menunjukkan kemampuan menghambat kerusakan sel hati. Hati merupakan tempat terjadinya detoksifikasi racun. Timbal merupakan logam yang
tidak dibutuhkan oleh tubuh yang merupakan racun. Kemampuan ekstrak etanol dosis 800 mgkg BB secara per oral dalam menghambat kerusakan sel hati diharapkan juga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dapat membantu penawarracunan timbal. Waktu antara pemberian Na
2
CaEDTA dan ekstrak etanol daun ketela pohon dijeda selama 2 jam berdasarkan t ½ eliminasi
Na
2
CaEDTA yaitu 2 jam. Dengan membandingkan kadar timbal dalam darah antar kelompok, maka dapat diamati apakah pemberian ekstrak etanol daun ketela pohon
setelah Na
2
CaEDTA efektif dalam menurunkan kadar timbal dalam darah hewan uji.
7. Penanganan hewan uji
Larutan timbal asetat dosis 0,5 gkgBBhari secara per oral diberikan ke hewan uji kelompok kontrol dan perlakuan timbal selama 30 hari. Antiracun
Na
2
CaEDTA diberikan pada hari ke-31 sampai 40 dengan dosis 189 mgkg BB tikus secara intra muskular. Setelah dua jam pemberian Na
2
CaEDTA, ekstrak etanol daun ketela pohon dengan dosis 800 mgkgBB tikus diberikan secara per oral pada hari ke-
31 sampai 40. 8.
Pengukuran kadar timbal darah dengan Spektroskopi Serapan Atom
a. Preparasi sampel. Darah tikus diambil dari sinus orbitalis mata, ditampung dalam effendrof,
kemudian ditimbang. Sampel didestruksi dengan HNO
3
p 10-15 ml dan HClO
4
0,5 ml hingga jernih dan tidak berasap kuning. Didinginkan dan volumenya ditepatkan
menjadi 10 ml. Sampel aquadest, air minum, dan pakan tikus juga diukur kadar timbalnya.
Berat sampel darah yang diambil dari sinus orbitalis mata harus lebih dari 0,5 gram karena kadar timbal dalam darah sangat kecil sehingga diperlukan berat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
sampel yang cukup banyak untuk dapat terukur. Destruksi sampel darah berdasarkan metode kimia basah wet chemical method. Efektifitas metode ini dilihat
dari kemampuan oksidasinya yang bergantung pada penambahan asam dan temperatur maksimal, sesuai titik didih asam yang digunakan.
HNO
3
pekat akan melarutkan timbal menjadi timbal nitrat yang dapat larut. Kekuatan oksidasinya meningkat dengan penambahan perklorat dan peningkatan
suhu serta tekanan saat proses digesti. HClO
4
pekat 60-72 akan menguraikan senyawa organik dalam suhu tinggi Walter, Chalk, and Kingston, 1998. Campuran HClO
4
dan HNO
3
digunakan untuk mengontrol proses digesti senyawa organik karena reaktivitas HClO
4
yang besar dapat meledak. Jika dicampur dengan HClO
4
, HNO
3
akan melarutkan timbal. Jika temperaturnya dinaikkan, HClO
4
akan menyempurnakan penguraian senyawa yang tidak dapat terurai oleh HNO
3
. Penambahan pereaksi HNO
3
p dan HClO
4
pada sampel darah akan menghasilkan garam Pb
2+
yang mudah larut dan lepas dari ikatannya dengan protein darah. Reaksinya adalah sebagai berikut:
3 Pb + 8 HNO
3
3 Pb
2+
+ 6 NO
3
+ 2 NO + 4 H
2
O
11 Vogel, 1979
Sampel dipanaskan hingga jernih, tidak berasap kuning, dan hampir mendekati kering untuk menguapkan pereaksi-pereaksi tersebut. Tujuan filtrasi
sampel hasil destruksi adalah untuk menghilangkan endapan yang terbentuk selama
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
proses destruksi terjadi. Selain itu, larutan sampel harus dalam keadaan jernih sebab kejernihan menjadi tanda bahwa seluruh material organik sudah terdestruksi.
b. Pengaturan spektroskopi serapan atom SSA. Pengaturan SSA untuk pengaturan kadar timbal adalah sebagai berikut :
Sumber cahaya : lampu hollow cathode timbal
Arus lampu : 7,5 mA
Panjang gelombang : 283,3 nm
Celah : 1,3 nm
Pengatom : standar burner
Oksidan : udara
Tekanan oksidan : 1,60 kgcm
2
99,5lmenit Bahan bakar
: C
2
H
2
Tekanan bahan bakar : 0,30 kgcm
2
2,3 Lmenit Tinggi burner
: 7,5 mm c. Pembuatan kurva baku
1 Pembuatan larutan baku timbal Larutan standar timbal 1000 ppm diambil sebanyak 1 ml kemudian
ditambah aquadest hingga volumenya tepat 10 ml. Dari larutan ini, dibuat seri larutan baku dengan konsentrasi 0,5 ppm, 1 ppm, 2 ppm, 4 ppm, 6 ppm, dan 8 ppm.
2 Pembuatan kurva baku timbal Kurva baku dibuat dengan mengukur nilai serapan seri kadar larutan baku
timbal pada ? 283,3 nm menggunakan SSA. Nilai serapan dan kadar dibuat
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
persamaan regresi linear sehingga diperoleh persamaan Y= bX + a Y: nilai serapan; X: kadar senyawa mgL; b: slope persamaan; a: intersept.
d. Penentuan kadar timbal darah kelompok perlakuan Nilai serapan dan mean konsentrasi yang diperoleh ppm dihitung dengan
rumus 12 sehingga diperoleh kadar timbal dalam sampel.
n pengencera
faktor gram
berat volume
blanko ppm
- sampel
larutan ppm
ppm Pb
Kadar ×
=
12 Anonim, 1980
F. Analisis Hasil
Pada penelitian ini, H dapat dirumuskan tidak adanya perbedaan kadar
timbal antara kelompok yang diberi ekstrak etanol daun ketela pohon dengan kelompok tanpa ekstrak etanol daun ketela pohon. Uji normalitas bertujuan untuk
mengetahui pola sebaran data. Jika p 0,05 berarti sebaran data normal sehingga dilanjutkan dengan uji parametrik tetapi jika data tidak normal maka dilanjutkan
dengan uji nonparametrik, misalnya dengan uji Kruskal Wallis. Uji Kruskal Wallis untuk mengetahui adanya perbedaan antar kelompok perlakuan. Jika p 0,05 berarti
paling tidak terdapat perbedaan kadar timbal antara dua kelompok. Uji Mann Whitney untuk mengetahui kelompok perlakuan yang berbeda. Jika p 0,05 berarti
paling tidak terdapat perbedaan kadar timbal antara dua kelompok yang dibandingkan. Uji Friedman dan Wilcoxon untuk mengetahui perbedaan kadar timbal
pada hari yang berbeda pada tiap kelompok perlakuan. Jika p 0,05 berarti terdapat perbedaan hasil pengukuran kadar timbal.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman dilakukan untuk mengetahui kebenaran tanaman yang digunakan pada penelitian. Determinasi dilakukan oleh Bapak Mujitomo dengan
mengacu pada Flora untuk Sekolah Indonesia. Hasil determinasi tanaman tersebut adalah sebagai berikut : 1b-2b-3b-4b-6b-9b-10b-11b-12b-13b-14a-15b-197a-198b-
200b-201b-202b-203b-204b-205b-206b-207aEuphorbiaceae-1b-3a-4b-5b-7a-8a- 6Manihot-Manihot utillissima Pohl.
Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman tersebut adalah ketela pohon Manihot utillissima Pohl.
B. Ekstraksi
Ekstrak cair ya ng diperoleh, disaring lalu diuapkan pelarutnya untuk mendapatkan ekstrak kental. Penguapan pelarut bertujuan untuk memperoleh zat aktif
dengan konsentrasi tinggi. Ekstrak kental yang diperoleh digunakan untuk mengetahui rendemen yang dihasilkan, Rendemen adalah perbandingan antara
ekstrak yang diperoleh dengan simplisia awal. Data perolehan rendemen dapat dilihat pada Tabel IV.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Kategori