10
Gambar 2.6. Pengaturan alat dan hewan coba pada proses perfusi dengan larutan
fiksatif sumber : Fixation and Fixatives : Popular Fixative Solutions, 2012
4
Ketika dapar akan selesai 200 ml, ganti alur katup dapar sehingga cairan fiksatif dapat masuk. Tekanan dapat ditingkatkan hingga 130 mmHg.
2.1.3. Perfusi PBS-Formalin
PBS Phosphate Buffer Saline adalah larutan fisiologis yang bisa digunakan dalam prosedur immune-histokimia. Larutan ini bersifat isotonik dan tidak beracun
terhadap sel serta bertujuan untuk menjaga kadar pH dan mempertahankan osmolaritas sel.
5
Saat ini, PBS sudah banyak digunakan sebagai 1.
Immunoassays 2.
Prosedur immune-histokimia 3.
Prosedur mikrobiologi 4.
Prosedur kultur jaringan dan sel 5.
Pengenceran suatu sampel
5
Jika suatu sel difiksasi menggunakan larutan yang hipertonik maka sel tersebut akan mudah menyusut, sebaliknya apabila sel difiksasi menggunakan larutan
yang hipotonik maka sel tersebut akan membengkak. Maka dari itu, dianjurkan menggunakan larutan isotonik seperti PBS sebagai larutan fiksasi yang baik.
5
11
Formalin merupakan larutan fiksatif, dimana larutan ini digunakan pada proses fiksasi jaringan. Tetapi pada proses perfusi juga dapat digunakan larutan
formalin yang dikombinasikan dengan PBS, dengan tujuan mendapatkan hasil yang lebih baik. Formalin yang dilarutkan dalam PBS atau bisa disebut PBS-Formalin
merupakan larutan yang direkomendasikan sebagai pilihan agen fiksatif yang terbaik.
6
Larutan fiksatif saat ini sedang dikembangkan yang sifat racunnya sangat minimal. PBS-Formalin paling sering digunakan sebagai agen fiksatif karena sifatnya
sebagai agen yang fleksibel. Selain itu, dengan larutan fiksatif PBS-Formalin ini dapat menjadikan organ yang akan diteliti menjadi lebih lama dapat disimpannya dan
proses autolisisnya sangat minimal.
11
2.1.4. Pengolahan Pembuatan Blok
Metode yang digunakan pada penelitian kali ini adalah metode parafin yaitu metode yang paling sering digunakan. Keuntungan menggunakan metode ini yaitu
pertama, irisan dapat lebih tipis dibandingkan menggunakan metode lainnya yaitu dapat mencapai ketebalan rata-rata 6 mikrometer. Kedua, irisan yang sifatnya seri
dapat dengan mudah dikerjakan. Ketiga, proses pengerjaannya lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin mikrotom beku. Selain keuntungan tentu ada
kerugian dari metode ini yaitu jaringannya akan menjadi keras, mengerut dan mudah patah serta untuk jaringan yang besar akan sulit dikerjakan dan enzim-enzim akan
larut pada metode ini.
1,2
Proses pengolahan pembuatan blok ini dimulai dari fiksasi, pencucian washing, dehidrasi, perjernihan clearing, infiltrasi parafin, penanaman
embedding, penyayatan section, penempelan affiksing, deparafinisasi, pewarnaan staining, penutupan mounting, dan labeling.
1,2
2.1.4.1. Fiksasi
Fiksasi merupakan suatu usaha untuk mempertahankan komponen-komponen sel atau jaringan agar tidak mengalami perubahan dan tidak mudah rusak. Proses
12
fiksasi ini dharapkan setiap molekul pada jaringan yang hidup tetap berada pada tempatnya dan tidak ada molekul baru yang timbul. Pada prosesnya ini tentu tidak
akan berjalan dengan sempurna, apabila timbul molekul asing baru pada jaringannya disebut artefak.
1,2
2.1.4.2. Dehidrasi
Dehidrasi merupakan metode yang digunakan untuk mengeluarkan seluruh cairan yang terdapat dalam jaringan setelah dilakukan proses fiksasi sehingga
nantinya dapat diisi dengan parafin untuk membuat blok preparat. Proses dehidrasi ini menggunakan alkohol bertingkat. Mulai dari alkohol 30, 50, 70, 80, 95,
dan alkohol absolut. Prosesnya, suatu jaringan akan dicelupkan dimasing-masing alkohol dengan kisaran waktu tertentu sampai prosesnya berakhir.
1,2
2.1.4.3. Penjernihan clearing
Penjernihan adalah metode yang digunakan mengeluarkan alkohol dari jaringan dan menggantikannya dengan suatu larutan yang berikatan dengan parafin.
Pada proses clearing ini sangat krusial karena apabila di jaringan masih tersisa alkohol walaupun sedikit, parafin tidak akan bisa masuk kedalam jaringan. Sehingga
jaringan nantinya tidak akan sempurna dalam pembuatan bloking, pemotongan, dan pewarnaan. Proses clearing ini menggunakan bermacam-macam zat penjernih yaitu
xylol atau xylene dan toluol atau toluene yang memiliki kelebihan dan kekurangannya masing-masing. Xylol atau xylene kelebihannya yaitu prosesnya cepat dan harganya
tidak terlalu mahal. Kekurangannya yaitu jaringan yang dapat dipindahkan hanya dari alkohol absolut, dan jaringan yang dijernihkan dengan xylene tidak begitu jelas
menjadi transparan, sehingga tidak diketahui proses ini berjalan sempurna atau tidak.
1,2
Toluol atau toluene kelebihannya yaitu sudah banyak dipergunakan oleh kebanyakan laboratorium, harganya murah, mudah didapat, dan jaringan yang
penjernihannya sempurna akan terlihat jelas transparan. Tetapi apabila jaringan tidak
13
terlihat transparan berarti proses dehidrasi yang sebelumnya belum sempurna. Kekurangannya yaitu jaringan hanya bisa dipindahkan dari alkohol absolut apabila
jaringan terlalu lama di toluol akan menyebabkan kerasnya jaringan sehingga sukar untuk dipotong menggunakan mikrotom.
1,2
2.1.4.4. Penanaman embedding
Penanaman embedding merupakan proses untuk mengeluarkan cairan pembening dari jaringan dan digantikan dengan parafin. Jaringan ini harus terbebas
dari cairan pembening karena nantinya akan mengkristal dan sewaktu dipotong jaringan akan mudah robek. Berdasarkan metode prosesnya yaitu jaringan akan di
dibenamkan di larutan parafin selama 3x dan dalam jangka waktu tertentu sambil dipanaskan agar parafinnya tidak membeku. Keuntungan menggunakan parafin
dengan titik lebur rendah yaitu jaringannya tidak mudah menjadi rapuh. Sedangkan keuntungan memakai paraplast yaitu sifat parafinnya sangat elastis sehingga tidak
mudah robek atau rusak ketika dipotong.
1,2
2.1.4.5. Pembuatan blocking
Pembuatan blocking merupakan proses pembuatan preparat agar dapat dipotong menggunakan mikrotom. Proses ini menggunakan parafin sebagai alat
menempelkan jaringannya agar mudah dipotong. Prosesnya yaitu dengan menyiapkan tempat blokingnya, dan menuangkan parafin dilanjutkan dengan memasukan organ
ke dalam parafin yang sudah disediakan. Selanjutnya setelah blok parafin kering dan sudah beku dapat dikeluarkan dari tempat blocking dan dapat dilanjutkan ke proses
selanjutnya.
1,2
Blok parafin yang sudah beku dan akan dipotong harus diberi label atau disebut affiksing, metode ini bertujuan agar diketahui organ yang akan dipotong
nanti. Pengecoran blocking adalah proses pembuatan blok preparat agar dapat dipotong dengan mikrotom.
1,2
2.1.4.6. Pemotongan Organ
14
Pemotongan organ dilakukan menggunakan alat khusus dengan pisau yang sangat tipis dan tajam yang disebut mikrotom. Mikrotom adalah alat yang dapat mengiris
potongan blok dengan sangat tipis dan sesuai dengan ukuran ketebalan yang kita inginkan.
12
Terdapat berbagai jenis mikrotom yaitu : 1.
Hand Microtome Merupakan jenis mikrotom yang sangat simpel dan biasanya digunakan untuk
memotong tumbuhan dan jaringan hewan, tetapi mikrotom jenis ini sangat terbatas kemampuannya untuk memotong jaringan setipis mungkin.
2. Rocking microtome
Mikrotom jenis ini merupakan jenis yang hanya bisa memotong jaringan yang lembut dan tingkat kesulitannya rendah. untuk jaringan yang lebih sulit
contohnya jaringan yang tingkat kekakuannya tinggi dapat menggunakan jenis rotary microtome atau base sledge microtome dibandingkan dengan rocking
microtome. 3.
Rotary microtome Mikrotom jenis ini memiliki banyak keuntungan dan jenis yang paling cocok
dengan metode blok parafin. Mikrotom ini juga dapat memotong jaringan yang sangat besar dan tingkat kesulitan yang besar. Dengan metode ini, blok
dapat dipotong hingga ketebalan 0,5 sampai 2 mikrometer. 4.
Freezing microtome Metode ini memiliki banyak keuntungan yaitu diantaranya prosesnya cepat,
jaringan yang mengkerut lebih sedikit dibandingkan dengan metode parafin serta hampir semua metode pewarnaan dapat dilakukan menggunakan metode
ini. Selain keuntungan ada juga keburukannya yaitu irisan yang tipis dan irisan yang seri sulit untuk diperoleh.
5. Base sledge microtome
Mikrotom jenis ini merupakan jenis yang paling banyak digunakan. Karena mikrotom jenis ini dapat memotong berbagai jenis, ukuran, dan tingkat
15
kekerasan suatu jaringan. Mikrotom jenis ini cara pengoperasiannya secara hidrolik sehingga memudahkan pemotongan dan dapat memotong bahan yang
sangat keras sekalipun.
12
2.1.5. Pewarnaan HE
Pewarnaan adalah teknik untuk memberikan warna pada komponen selular dengan tujuan dapat membedakan antar sel tersebut. Warna adalah persepsi dari mata
yang dapat dibedakan berdasarkan panjang gelombang. Teknik pewarnaan ini membantu dalam menghasilkan kontras dimana setiap warna memiliki afinitasnya
masing-masing. Contohnya pewarnaan sel, yaitu nukleus memiliki afinitas tinggi terhadap pewarnaan hematoksilin. Sedangkan sitoplasma memiliki afinitas tinggi
terhadap pewarnaan eosin.
13
Pewarnaan dengan menggunakan hematoksilin dan eosin memang metode yang paling banyak digunakan dalam pembuatan preparat histologis. Pewarnaan ini
terdiri dari 2 jenis zat warna, yaitu hematoksilin yang fungsinya untuk mewarnai inti sel menjadi biru. Sedangkan eosin fungsinya untuk mewarnai sitoplasma menjadi
merah.
12
Hematoksilin merupakan zat warna alami yang dapat mengikat inti sel dengan ikatan yang lemah. Ikatan yang lemah ini dapat berubah apabila ditambahkan dengan
senyawa lain. Selain itu, hematoksilin harus dioksidasi terlebih dahulu menjadi hematein agar dapat dijadikan sebagai pewarna inti sel. Eosin merupakan zat warna
yang fungsinya untuk mewarnai sitoplasma. eosin akan memberikan beberapa corakan pada jaringan. Berbagai corakan pada jaringan ini dapat bertambah bila
pewarnaan yang digunakan lebih dari satu.
12
2.1.6. Histologi Organ
