UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dalam campuran BHI dan suspensi bakteri sebanyak 10 ml selama 5 detik, selanjutnya disimpan dalam petri dish dan diletakkan kapas yang dibasahi
dengan aquadest yang telah disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan larutan p-
iodonitrotetrazolium violet INT konsentrasi 2 mgml, dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C Sabariah Ismail, 2011. Untuk mengetahui nilai Rf senyawa aktif antibakteri maka
dilakukan uji bioautografi pada fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi, yaitu fraksi yang memiliki diameter zona hambat
terbesar. Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh larutan fraksi dengan konsentrasi
50 mgml. Larutan fraksi sebanyak 10 µ l ditotolkan pada plat KLT, kemudian dielusi menggunakan fasa gerak n
– heksana : etil asetat. Setelah larutan fraksi dielusi, plat KLT dicelupkan dalam campuran BHI dan
suspensi bakteri selama 5 detik, selanjutnya disimpan dalam petri dish dan diletakkan kapas yang dibasahi dengan aquadest yang telah disterilkan.
Plat diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet INT, dan
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C Sabariah Ismail, 2011
3.3.11 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum KHM Fraksi yang
Mempunyai Aktivitas Antibakteri Tertinggi 3.3.11.1
Pembuatan Medium
Medium yang digunakan adalah medium NB Nutrient Broth untuk pertumbuhan bakteri uji. Medium NB 1 dibuat dengan cara
melarutkan 8 g NB dalam 1 liter aquadest dan medium NB 2 dibuat dengan komposisi 2x medium NB 1 16 g dalam 1 liter aquadest.
3.3.11.2 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri Gram positif dan Gram negatif yang telah diremajakan pada umur 24 jam diambil 1 ose dan dimasukkan dalam 10 ml NB
inokulum lalu dikocok menggunakan shaker incubator selama 24 jam pada suhu 37˚C.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Setelah 24 jam tabung menjadi keruh yang menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri. Kekeruhan kultur dibandingkan dengan larutan Mc.
Farland 0,5 yang setara dengan 10
8
CFUml. Kemudian dilakukan pengenceran sampai diperoleh suspensi bakteri 10
6
CFU ml dengan cara mengambil 1 ml dari tabung 10
8
CFUml dicampur dengan 9 ml NaCl 0,9 steril, maka akan didapat suspensi bakteri dengan kepadatan
10
7
CFUml. Dilanjutkan dengan mengambil 1 ml lagi dari tabung 10
7
CFUml untuk dicampur dengan 9 ml Nutrient Broth sehingga didapatkan suspensi dengan kepadatan 10
6
CFU ml Bobby wahyu W, dkk. 2013.
3.3.11.3 Pengenceran Larutan Uji
Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri ditentukan nilai KHM dengan metode mikrodilusi, dibuat pengenceran larutan uji dari larutan
induk 50000 µgml menjadi, 12500 µgml, 6250 µgml, 3125 µgml, 1562,5 µgml, 781,25 µgml, 390,66 µgml, 195,31 µgml, 97,66 µgml
menggunakan microtiter plate 96 sumur, dengan komposisi sebagai berikut:
a Sumur A1 – A6 diisi dengan 100 µl medium NB 2
b Sumur B1 – H6 diisi dengan 100 µl medium NB 1
c Sumur A1 – A3 diisi dengan 100 µl sampel uji
d Sumur A4 – A6 diisi dengan 100 µl tetrasiklin antibiotic control
e Dari sumur A1 – A6 masing – masing diambil 100 µl dan
dimasukkan dalam sumur B1 – B6, begitu seterusnya sampai
sumur F1 – F6 diambil 100 µl lalu dibuang.
f Sumur A7 diisi 200 µl dengan medium NB 2 Sterility control
g Sumur B7 diisi 100 µl dengan medium NB 1 Sterility control
h Sumur C7 – D7 diisi 100 µl dengan medium NB 1 Growth
control i
Sumur E7 – F7 diisi 100 µl dengan medium NB 2 dan 100 µl DMSO dan dibuang 100 µl Solvent control
j Masing – masing sumur ditambah dengan bakteri uji 100 µl kecuali
sumur untuk sterility control.
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.11.4 Inkubasi Microtiter plate yang Berisi Sampel Uji
Microtiter plate yang berisi sampel uji diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 24 jam.
3.3.11.5 Penentuan Nilai KHM
Setelah diinkubasi selama 24 jam, microtiter plate ditambahkan p- iodonitrotetrazolium violet INT 0,5 mg ml, 20 µ l ke dalam microtiter
plate. Perubahan warna merah menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri.
Nilai KHM ditentukan sebagai konsentrasi terendah dari sampel uji dalam sumur yang tidak membentuk warna merah Sabariah Ismail 2011.
3.3.12 Analisa Komponen Senyawa Fraksi yang Mempunyai Aktivitas
