UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
tersisa kembali ditambahkan n – heksana dan proses maserasi dilakukan
kembali sampai pelarut berwarna bening. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.
Selanjutnya ampas dimaserasi dengan pelarut etil asetat selama 2 hari dengan beberapa kali pengadukan. Kemudian hasil maserasi
difiltrasi, ampas yang tersisa dimaserasi kembali dengan etil asetat sampai pelarut berwarna bening. Filtrat yang diperoleh diuapkan dengan vacuum
rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental.
Ampas di maserasi dengan pelarut metanol selama 2 hari dengan beberapa kali pengadukan. Kemudian hasil maserasi difiltrasi. Ampas
yang tersisa kembali ditambahkan metanol dan proses maserasi dilakukan kembali sampai pelarut berwarna bening. Filtrat yang diperoleh diuapkan
dengan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Penguapan pelarut menggunakan vacuum rotary evaporator
dilakukan pada suhu 45
o
C. Ekstrak disimpan dalam lemari pendingin pada suhu 4
o
C untuk memperpanjang masa simpan sampai siap digunakan untuk uji aktivitas antibakteri.
Rendemen ekstrak dinyatakan dalam persen dihitung menggunakan
persamaan:
Rendemen ekstrak = x 100
3.3.4 Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram digunakan untuk identifikasi anggota dari domain bakteri ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya.
Bakteri Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa diambil masing
– masing 1 ose dan digores-goreskan pada permukaan kaca objek steril, ditetesi NaCl 0,9 , kemudian dilakukan fiksasi. Kristal violet
sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek yang terdapat lapisan bakteri tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Setelah 1 menit,
kaca objek dibilas dengan air sampai zat warna luntur. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, larutan lugol sebanyak
1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek tersebut dan didiamkan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
selama 1 menit. Setelah 1 menit, kaca objek dibilas dengan air. Kaca objek dibilas dengan alkohol 96 sampai semua zat warna luntur kemudian
dicuci dengan air. Kaca objek dikeringkan di atas api spiritus. Setelah kering, safranin sebanyak 1 tetes ditambahkan ke permukaan kaca objek
dan didiamkan selama 45 detik. Preparat dicuci dengan air dan dikeringkan. Preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran
100x Surya rosa putra, 2012.
3.3.5 Uji Aktivitas Antibakteri Ekstrak n
– heksana, Etil asetat dan Metanol daun
Cinnamomum sintoc dengan Metode Difusi Cakram 3.3.5.1
Sterilisasi Alat dan Bahan Sterilisasi dilakukan dengan beberapa cara, yaitu:
a. Sterilisasi dengan pemijaran, yaitu pembakaran alat – alat diatas lampu
spiritus sampai pijar seperti ose, batang L, dan mulut tabung biakan. b.
Sterilisasi dengan uap yang bertekanan autoklaf, yaitu sterilisasi dengan menggunakan suhu 121˚C selama 15 menit. Bahan – bahan
seperti media NB, NA, BHI, Aquadest disterilkan dengan autoklaf dan juga alat-alat gelas seperti cawan petri, beacker glass, spreader.
3.3.5.2 Pembuatan Medium
3.3.5.2.1 Nutrien Agar NA
Medium yang digunakan untuk membiakkan bakteri uji adalah medium NA. Serbuk NA sebanyak 20 gram dilarutkan dalam 1 liter
aquadest dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit. Setelah
agak dingin, disimpan dalam lemari pendingin dan dapat digunakan bila diperlukan dengan memanaskannya kembali dengan hot plate.
Untuk membuat agar miring, NA yang telah disterilkan dituang pada suhu 60
– 50
o
C kedalam tabung reaksi yang telah disterilkan sebanyak 5 ml, kemudian disumbat dengan kapas steril dan
diposisikan miring sekitar 45
o
kemudian ditunggu sampai mengeras.
3.3.5.2.2 Nutrien Broth NB
Serbuk NB sebanyak 8 gram dilarutkan dalam 1 liter aquadest dan dipanaskan sampai mendidih sehingga larut. Lalu disterilkan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dalam autoklaf pada suhu 121˚C selama 15 menit. Setelah agak dingin NB dapat disimpan dalam lemari pendingin.
3.3.5.3 Peremajaan Bakteri dan Pembuatan Kultur Kerja
Disiapkan agar miring NA steril, lalu diambil stok bakteri Staphylococcus aureus
ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 dengan menggunakan ose steril yang telah dipijarkan lalu ditanam
pada permukaan agar miring dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37˚C.
3.3.5.4 Pembuatan Suspensi Bakteri
Bakteri Staphylococcus aureus ATCC 25923 dan Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 yang telah diremajakan pada umur 24 jam diambil 1 ose dan dimasukkan dalam 10 ml NB inokulum lalu dikocok
menggunakan shaker incubator selama 24 jam pada suhu 37˚C.
Setelah 24 jam tabung menjadi keruh yang menunjukkan adanya pertumbuhan bakteri. Kekeruhan kultur dibandingkan dengan larutan Mc.
Farland 0,5 yang setara dengan 10
8
CFUml. Kemudian dilakukan pengenceran sampai diperoleh suspensi bakteri 10
6
CFU ml dengan cara mengambil 1 ml dari tabung 10
8
CFUml dicampur dengan 9 ml NaCl 0,9 steril, maka akan didapat suspensi bakteri dengan kepadatan
10
7
CFUml. dilanjutkan dengan mengambil 1 ml lagi dari tabung 10
7
CFUml untuk dicampur dengan 9 ml Nutrient Broth sehingga didapatkan suspensi bakteri dengan kepadatan 10
6
CFUml Bobby wahyu dkk, 2013
3.3.5.5 Penentuan Diameter Zona Hambat
Media cair nutrient agar yang sudah disterilkan dituang secara aseptis sebanyak 20 ml pada cawan petri berdiameter 9 cm yang sudah
disterilkan hingga merata, kemudian dibiarkan hingga membeku. Setelah media nutrient agar membeku, celupkan 1 ose kapas kedalam suspensi
bakteri, kemudian inokulasikan bakteri yang telah diambil dengan ose tersebut pada media nutrient agar.
Paper disc yang telah disterilkan diameter 6 mm diteteskan 25 µ l
ekstrak metanol, etil asetat dan n – heksana yang masing – masing
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dilarutkan dalam DMSO 15 15 DMSO dan 65 Aquadest sehingga diperoleh konsentrasi 50 mgml. Kemudian paper disc yang telah ditetesi
larutan ekstrak, ditunggu selama 10 detik sampai ekstrak tersebut menyerap pada paper disc dan diletakkan diatas permukaan lempeng agar
yang telah diinokulasikan bakteri. Kontrol negatif digunakan DMSO 15, Kontrol positif digunakan antibiotik Tetrasiklin 1000 ppm. Kemudian
diinkubasi pada temperatur 37
o
C selama 24 jam. Zona hambat yang terbentuk diukur dengan menggunakan jangka sorong. Pengujian
dilakukan sebanyak dua kali duplo. Ekstrak yang memiliki aktivitas anitibakteri tertinggi kemudian difraksinasi menggunakan kromatografi
kolom.
3.3.6 Skrining Fitokimia Ekstrak yang Memiliki Aktivitas Antibakteri
