UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.3.9.3 Proses fraksinasi
Ekstrak etil asetat, selanjutnya difraksinasi menggunakan kromatografi kolom. Sistem pelarut yang digunakan yaitu sistem gradien.
Dengan komposisi pelarut yang digunakan yaitu n-heksana dan etil asetat, dimana setiap gradien kepolarannya ditingkatkan 5. Fraksinasi pertama
dimulai dari menggunakan pelarut n-heksan 100 sebanyak 250 ml. Eluat ditampung setiap 50 ml. Penggantian gradien fasa gerak dilakukan ketika
gradien sebelumnya telah habis digunakan untuk mengaliri kolom. Fraksinasi dilakukan hingga fasa gerak yang digunakan telah
mencapai gradien akhir yaitu etil asetat 100. Semua eluat yang diperoleh, dikeringkan terlebih dulu dengan cara diangin
– anginkan kemudian diuji dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT untuk melihat
pola noda masing – masing eluat. Eluat yang memberikan pola noda
dengan nilai Rf yang sama, digabungkan menjadi satu dan selanjutnya diuji aktivitas antibakteri menggunakan metode bioautografi.
3.3.10 Uji Aktivitas Antibakteri Fraksi dari Ekstrak yang Memiliki Aktivitas
Antibakteri Tertinggi dengan Metode Bioautografi
Untuk menentukan fraksi dari ekstrak etil asetat daun Cinnamomum sintoc yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi, maka dilakukan uji
antibakteri dengan metode bioautografi. 3.3.10.1
Pembuatan Suspensi Bakteri
Stok bakteri uji S.aureus dan P.aeruginosa yang telah diremajakan pada medium NA miring diambil 1 ose, lalu disuspensikan ke dalam 10 ml
medium BHI Brain Heart Infusion, kemudian diinkubasi dalam shaker incubator
dengan kecepatan 100 rpm pada suhu 37
o
C selama 24 jam. 3.3.10.2
Uji Bioautografi Fraksi Hasil Kromatografi Kolom
Fraksi hasil kromatografi kolom yang telah digabungkan berdasarkan nilai Rf, masing
– masing dilarutkan dengan kloroform dan etil asetat sehingga diperoleh larutan fraksi dengan konsentrasi 50 mgml.
Larutan fraksi sebanyak 10 µ l ditotolkan pada plat KLT berukuran 6,5 x 7 cm kemudian dikering anginkan untuk menghilangkan pelarutnya.
Plat KLT yang telah ditotolkan larutan fraksi sebanyak 10 µ l, dicelupkan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dalam campuran BHI dan suspensi bakteri sebanyak 10 ml selama 5 detik, selanjutnya disimpan dalam petri dish dan diletakkan kapas yang dibasahi
dengan aquadest yang telah disterilkan. Plat diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan larutan p-
iodonitrotetrazolium violet INT konsentrasi 2 mgml, dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C Sabariah Ismail, 2011. Untuk mengetahui nilai Rf senyawa aktif antibakteri maka
dilakukan uji bioautografi pada fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi, yaitu fraksi yang memiliki diameter zona hambat
terbesar. Fraksi yang mempunyai aktivitas antibakteri tertinggi dilarutkan dengan etil asetat sehingga diperoleh larutan fraksi dengan konsentrasi
50 mgml. Larutan fraksi sebanyak 10 µ l ditotolkan pada plat KLT, kemudian dielusi menggunakan fasa gerak n
– heksana : etil asetat. Setelah larutan fraksi dielusi, plat KLT dicelupkan dalam campuran BHI dan
suspensi bakteri selama 5 detik, selanjutnya disimpan dalam petri dish dan diletakkan kapas yang dibasahi dengan aquadest yang telah disterilkan.
Plat diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 jam, setelah diinkubasi plat disemprot dengan larutan p-iodonitrotetrazolium violet INT, dan
diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37
o
C Sabariah Ismail, 2011
3.3.11 Penentuan Nilai Konsentrasi Hambat Minimum KHM Fraksi yang
Kategori