3.6.2.4. Pembuatan Media Salmonella Shigela Agar SSA dan Penanaman
Sampel
Masukkan akuades 40 ml ke dalam tabung Erlenmeyer 250 ml dan tutup dengan kapas,kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam. Timbang media SSA
sebanyak 2,4 gram, lalu masukkan media SSA ke dalam tabung Erlenmeyer yang telah di sterilisasi, kemudian dipanaskan pada
hotplate selama ± 15 menit 150˚C.
setelah itu tuang media kedalam cawan petri ± 20ml dan dinginkan, bila telah mengeras masukkan kedalam kulkas bersuhu 3
˚C. Setelah tahap pengenceran, ambil 0,1 ml dengan menggunakan mikropipet
pada tabung reaksi dengan media Nutrient Broth NB dengan pengenceran 10
-1
, lalu diletakkan pada media
Salmonella Shigella Agar SSA. Siapkan batang L dan rendam pada alkohol setelah itu dilewatkan di api dan diamkan hingga tidak panas.
Goreskan batang L diatas media SSA untuk meratakan larutan sampel. Kemudian inkubasi selama 24 jam, setelah itu lihat hasil pertumbuhan koloni bakteri untuk
dilakukan tahap pewarnaan Gram dan uji biokimia.
3.6.2.5. Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram
Bakteri yang telah tumbuh di media spesifik EMB dan SSA akan dilakukan pewarnaan Gram. Mula-mula panaskan ose diatas api, ambil NaCl menggunakan ose,
teteskan diatas kaca objek yang telah diberi batas bentuk oval dibagian bawahnya. Panaskan ose diatas api kembali, ambil koloni bakteri dalam media dan oleskan pada
kaca objek dan ratakan dengan NaCl atau akuades steril yang telah diteteskan sebelumnya tidak melewati batas. Keringkan diatas api kecil atau diamkan hingga
mengering dengan sendirinya. Teteskan Kristal Karbol Ungu KKU atau Gentian Violet, diamkan selama 5 menit dan bilas dengan air mengalir. Teteskan lugol,
diamkan selama 3 menit dan bilas dengan air mengalir. Teteskan alkohol 96 hingga tidak ada lagi larutan ungu yang luntur. Teteskan safranin, diamkan selama 45 detik-1
menit dan bilas dengan air mengalir. Keringkan dengan menggunakan tisu dengan tidak mengusap bagian atas gelas objek. Beri minyak immersi dan lihat dibawah
mikroskop pembesaran 100x.
3.6.2.6. Pembuatan dan Identifikasi Koloni dengan Uji Biokimia 1.
Fermentasi karbohidrat
Serbuk gula-gula glukosa, laktosa, maltosa, mannitol, dan sukrosa ditimbang sebanyak 0,5 gram dan pepton water 0,5 gram, lalu masukkan
kedalam tabung erlenmeyer 250mL yang telah berisi 50 mL akuades, kemudian dipanaskan pada
hotplate selama ± 15 menit, 150 C. Selagi
memanaskan masukkan sebuk bom chresol purple secukupnya hingga warna
bercampur. Setelah dipanaskan masukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 4 ml dan masukkan tabung durham kedalam tabung reaksi, kemudian masukkan
seluruh tabung reaksi kedalam plastik lalu sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, setelah itu masukkan kedalam kulkas bersuhu 3
C. Setelah koloni tumbuh pada media EMB dan SSA, ambil koloni
kuman dengan menggunakan ose bulat, lalu masukkan koloni pada uji gula- gula dan dikocok agar bakteri menyebar, dan lakukan juga pada koloni yang
berbeda. Kemudian inkubasi selama 24 jam dengan suhu 35 C, keesokan
harinya dilakukan pengamatan dengan melihat warna media uji. Hasil positif + jika warna media berubah menjadi warna kuning yang menandakan
keadaan asam dengan atau tanpa pembentukan gas pada tabung durham.
2. SIM Sulfide Indole Motility
Serbuk SIM ditimbang sebanyak 2 gram, lalu masukkan kedalam tabung erlenmeyer 250 mL yang telah berisi 50 mL akuades, kemudian
panaskan pada hotplate selama ± 15 menit
150˚C. Setelah dipanaskan masukkan kedalam tabung reaksi sebanyak 4 ml, masukkan seluruh tabung
reaksi kedalam plastik lalu sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian masukkan kedalam kulkas bersuhu 3
C. Ambil koloni yang tumbuh pada media EMB dan SSA dengan
menggunakan ose jarum, lalu tusuk lurus pada media uji SIM selanjutnya di inkubasi selama 24 jam pada suhu 35
C. Keesokan harinya amati perubahan
Kategori