bakteri yang dihasilkan dan kontrol negatif. Setelah diambil 0,1 ml diletakkan pada 2 cawan petri dan diberikan label sesuai dengan pengenceran, contoh: 1-1, 1-2 sampai
dengan 5-1, 5-2. Pada kontrol negatif, teteskan 0,1 ml NB tanpa dicampur dengan sampel
lalu diletakkan pada satu cawan petri saja dan diberi label “kontrol”. Siapkan batang L dan rendam dalam larutan alkohol. Setiap akan digunakan batang L ini di
dikeluarkan dari larutan alkohol, kemudian dilewati diatas api 1-2 kali, diamkan sebentar hingga sudah tidak panas. Goreskan batang L diatas media agar untuk
meratakan larutan sampel dengan menggunakan metode sebar spread plate, lalu
inkubasi selama 24 jam setelah itu hitung jumlah koloni yang tumbuh pada media NA.
3.6.2.3. Pembuatan Media Eosin Methylen Blue Agar EMB dan Penanaman
Sampel
Media EMBA ditimbang sebanyak 1,5 gram, lalu dimasukkan ke dalam gelas beker yang telah berisi 40 mL akuades, kemudian panaskan pada
hotplate selama ± 15 menit
150˚C. Setelah itu masukkan ke dalam tabung erlenmeyer 250 ml, dan tutup dengan kapas. Kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam, kemudian tuang
media kedalam cawan petri ± 20ml dan dinginkan, bila telah mengeras masukkan kedalam kulkas bersuhu 3
˚C. Setelah tahap pengenceran, ambil 0,1 ml dengan menggunakan mikropipet
pada tabung reaksi dengan media Nutrient Broth NB dengan pengenceran 10
-1
, lalu diletakkan pada media
Eosin Methylen Blue Agar EMB. Siapkan batang L dan rendam pada alkohol setelah itu dilewatkan di api, dan diamkan hingga tidak panas.
Goreskan batang L diatas media EMB untuk meratakan larutan sampel. Kemudian inkubasi selama 24 jam, setelah itu lihat hasil pertumbuhan koloni bakteri untuk
dilakukan tahap pewarnaan Gram dan uji biokimia.
3.6.2.4. Pembuatan Media Salmonella Shigela Agar SSA dan Penanaman
Sampel
Masukkan akuades 40 ml ke dalam tabung Erlenmeyer 250 ml dan tutup dengan kapas,kemudian sterilisasi di autoklaf selama ± 1-2 jam. Timbang media SSA
sebanyak 2,4 gram, lalu masukkan media SSA ke dalam tabung Erlenmeyer yang telah di sterilisasi, kemudian dipanaskan pada
hotplate selama ± 15 menit 150˚C.
setelah itu tuang media kedalam cawan petri ± 20ml dan dinginkan, bila telah mengeras masukkan kedalam kulkas bersuhu 3
˚C. Setelah tahap pengenceran, ambil 0,1 ml dengan menggunakan mikropipet
pada tabung reaksi dengan media Nutrient Broth NB dengan pengenceran 10
-1
, lalu diletakkan pada media
Salmonella Shigella Agar SSA. Siapkan batang L dan rendam pada alkohol setelah itu dilewatkan di api dan diamkan hingga tidak panas.
Goreskan batang L diatas media SSA untuk meratakan larutan sampel. Kemudian inkubasi selama 24 jam, setelah itu lihat hasil pertumbuhan koloni bakteri untuk
dilakukan tahap pewarnaan Gram dan uji biokimia.
3.6.2.5. Identifikasi Bakteri dengan Pewarnaan Gram
Bakteri yang telah tumbuh di media spesifik EMB dan SSA akan dilakukan pewarnaan Gram. Mula-mula panaskan ose diatas api, ambil NaCl menggunakan ose,
teteskan diatas kaca objek yang telah diberi batas bentuk oval dibagian bawahnya. Panaskan ose diatas api kembali, ambil koloni bakteri dalam media dan oleskan pada
kaca objek dan ratakan dengan NaCl atau akuades steril yang telah diteteskan sebelumnya tidak melewati batas. Keringkan diatas api kecil atau diamkan hingga
mengering dengan sendirinya. Teteskan Kristal Karbol Ungu KKU atau Gentian Violet, diamkan selama 5 menit dan bilas dengan air mengalir. Teteskan lugol,
diamkan selama 3 menit dan bilas dengan air mengalir. Teteskan alkohol 96 hingga tidak ada lagi larutan ungu yang luntur. Teteskan safranin, diamkan selama 45 detik-1
menit dan bilas dengan air mengalir. Keringkan dengan menggunakan tisu dengan tidak mengusap bagian atas gelas objek. Beri minyak immersi dan lihat dibawah
mikroskop pembesaran 100x.
