mempunyai rerata yang paling kecil yang menunjukan pada konsentrasi ini efek penurunan sel neutrofilnya paling besar jika dibandingkan dengan konsentrasi
lainnya. Namun secara statistik ketiga konsentrasi berbeda tidak bermakna. Hal ini menunjukan bahwa dari ketiga ekstrak tersebut memiliki efek penurunan sel
neutrofil yang sama menurut statistik. Berdasarkan penelitian Hadaruga et al., 2009 kandungan pada ekstrak
buah Milk Thistle antara lain 65-85 flavonolignans silymarin seperti silychristin, isosilychristin, silydianin, silybin A dan B, isosilybin A dan B, dan
juga 20-35 asam lemak, flavonoid, stimulan metabolik dan polifenol lainnya. Selain mengandung flavolignans silymarin tanaman Milk Thistle juga
mengandung tyramine, histamine, asam linoleat gamma, dan minyak esensial. Senyawa flavonoid memiliki aktivitas antioksidan dalam menangkap radikal
bebas sehingga memiliki efek antiinflamasi. Senyawa tersebut juga dapat mengatur aktivitas regulasi seluler dari sel-sel peradangan seperti, sel mast,
makrofag, limfosit dan neutrofil. Flavonoid juga dapat menghambat degranulasi neutrofil, dan juga mengurangi pelepasan asam arakidonat oleh neutrofil dan sel-
sel mediator inflamasi lainnya. Sehingga dapat mengurangi eksudat dan jumlah migrasi leukosit Kim et al., 2004.
D. Hasil Persen Penghambatan Ekspresi COX-2 Ekstrak Milk Thistle
Dengan Metode Imunohistokimia Dengan Antibodi Anti-COX-2
Tujuan dari uji immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 yaitu mengetahui mekanisme antinflamasi dari ekstrak Milk Thistle melalui
pemeriksaan ekspresi protein COX-2. Pemeriksaan ini dilakukan dengan PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
dilakukan pengecatan mengunakan antibodi anti COX-2 terhadap sel kulit punggung kulit yang selanjutnya dianalisis secara kuantitatif.
Enzim siklooksigenase cyclooxygenase = COX merupakan enzim kunci yang menghidrolisis asam arakidonat AA menjadi prostaglandin, COX-1 dan
COX-2, keduanya merupakan jenis enzim COX. COX-1 hampir pada semua jaringan, terutama pada saluran cerna dan ginjal, yang mempertahankan fungsi
fisiologi normal jaringan Akmal dkk., 2007. COX-2 adalah enzim dalam bentuk indusibel, dan tidak terdeteksi dalam semua sel dan jaringan normal,akan tetapi
COX-2 akan cepat terinduksi apabila sel menerima stimulus inflamasi Widiastuti, 2011.
Migrasi sel darah putih leukosit pada daerah cedera jaringan atau infeksi merupakan respon imun tubuh selama proses inflamasi. Karakteristik
utama pada inflamasi akut adalah migrasi leukosit terutama neutrofil. Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama
sehingga enzim COX-2 pada penelitian ini di ekspresikan oleh sel neutrofil. Sel yang mengekspresi COX-2 akan menunjukan warna coklat atau gelap, sedangkan
yang tidak mengekspresikan COX-2 menunjukan warna biru Kimet al., 2004. Ekspresi COX-2 dapat dilihat pada gambar 9.
Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap COX-2 pada sel neutrofil tanda lingkaran kuning di daerah subkutan
jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran 100 kali 1 dan 400 kali 2. Tanda panah kuning
menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah merah menunjukkan hasil negatif COX-2.
Pada penelitian efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle menunjukkan adanya ekspresi COX-2 pada daerah sub kutan. Kemudian ditentukan persen
penghambatan ekspresi COX-2 dengan menghitung pada masing-masing kelompok perlakuan menggunakan uji statistik Shapiro-wilk untuk melihat data
pada penelitian ini menunjukkan hasil yang terdistribusi normal atau tidak. Dari hasil yang diperoleh dari uji Shapiro-wilk menunjukkan bahwa data yang sudah
diolah tidak terdistribusi secara normal. Dengan hasil p = 0,015 hal ini menunjukkan bahwa kontrol negatif 0,05 Sig 0,005 walaupun data kelompok
1 2
lain 0,05. Kemudian dilakukan pengujian homogenitas dengan hasil data tidak homogen yaitu p=0,049 p0,05. Hasil uji normalitas dan homogenitas data yang
sudah diolah menunjukan bahwa data tidak normal dan tidak homogen makan dilakukan analisis data dengan analisis statistik non-parameter. Dengan
melakukan uji Kruskal wallis yang bertujuan untuk melihat data yang dianalisis apakah ada yang berbeda atau tidak. Hasil uji tersebut didapatkan hasil p = 0,000
p0,05. Karena nilainya kurang dari dari 0,05 sig 0,05 maka disimpulkan terdapat perbedaan antara kelompok data diatas sekurangnya ada 2 kelompok
yang berbeda. Untuk menguji perbedaan antara kelompok analisis dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney untuk melihat perbedaan masing-masing kelompok
perlakuan satu per satu apakah bermakna atau tidak bermakna. Hasil dari uji ini menunjukkan bahwa penghambatan ekspresi COX-2 antar tiap kelompok
perlakuan terdapat
perbedaan yang
bermakna. Hasil
pengecatan immunohistokimia dengan antibodi anti COX-2 masing-masing perlakuan beserta
kontrol dapat dilihat pada gambar 10 dan tabel 3. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 10.Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan Milk Thistle konsentrasi
2,5 beserta kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah
subkutan jaringan kulit tanda lingkaran kuning
Keterangan :
1. Kulit normal dengan perbesaran 100 kali
2. Kulit normal dengan perbesaran 400 kali
3. Kulit kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 100 kali
4. Kulit kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 400 kali
5. Kulit Milk Thistle 2,5 dengan perbesaran 100 kali
6. Kulit ekstrak Milk Thistle 2,5 dengan perbesaran 400 kali
3 4
5 6
2 1
Tabel 3.Rerata persen penghambatan ekspresi COX-2 pada kelompok perlakunan beserta kontrol.
I II
III IV
V VI
Rerata PI ± SE
I BTB
BB BB
BB BB
1,44 ± 0,37 II
BTB BB
BB BB
BB 2,01 ± 0,22
III BB
BB BB
BB BB
76,60 ± 0,88 IV
BB BB
BB BTB
BTB 11,56 ± 1,24
V BB
BB BB
BTB BB
13,96± 1,03 VI
BB BB
BB BTB
BB 8,48 ± 0,87
Keterangan: I
: Kontrol negatif Karagenin 3 II
: Kontrol Biocream ® III
: Kontrol positif Hidrokortison asetat 2,5 IV
: Ekstrak Milk Thistle 1,67 V
: Ekstrak Milk Thistle 2,5 VI
: Ekstrak Milk Thistle 3,75 BB
: Berbeda bermakna p 0,05 BTB
: Berbeda tidak bermakna p 0,05 SE
: Standart error PI
: Persen penghambatan inflamasi
Tabel 3 memperlihatkan bahwa masing-masing konsentrasi ekstrak Milk Thistle mempunyai efek antiinflamasi dalam menghambat COX-2 yang dapat
dilihat dari hasil rerata pada tabel diatas.Berdasarkan data tersebut rerata kontrol negatif karagenin dan biocream menunjukan nilai yang paling kecil jika di
bandingkan dengan perlakuan yang lain. Secara statistik kontrol negatif karagenin dan biocream berbeda tidak bermakna, dapat diartikan keduanya
mempunyai aktifitas yang sama yaitu belum mampu memberikan aktifitas penghambatan ekspresi COX-2. Jika dilihat dari rerata persen penghambatan
ekspresi COX-2 ketiga konsentrasi mempunyai persen penghambatan yang lebih besar dibandingkan dengan kontrol negatif dan biocream. Serta secara statistik
mempunyai hubungan yang berbeda bermakna. Hal ini menunjukan bahwa ketiga konsentrasi tidak memiliki aktifitas yang sama dengan kontrol negatif dan
biocream. Ketiga konsentrasi secara statistik memiliki aktivitas antiinflamasi. Untuk persen penghambatan kontrol positif mempunyai nilai yang paling besar
jika dibandingkan dengan kontrol negatif dan biocream. Secara statistik mempunyai hubungan berbeda bermakna. Dapat diartikan secara statistik kontrol
positif mempunyai aktifitas yang berbeda dengan kontrol negatif dan biocream yakni kontrol positif mampu menghambat ekspresi COX-2. Data tersebut
diperoleh persen penghambatan ekspresi COX-2 pada kontrol positif hidrokosrtison asetat 2,5 sebesar 76,60. Sedangkan pada kelompok
perlakuan ekstrak Milk Thistle masing-masing konsentrasi yaitu 1,67; 2,5 dan 3,75 menunjukkan penghambatan sebesar11,56;13,95; dan 8,48. Dapat dilihat
bahwa pada pemberian ekstrak Milk Thistle konsentrasi 3,75 terdapat penurunan persen penghambatan ekspresi COX-2. Hal ini menunjukkan ketiga konsentrasi
tidak ada kekerabatan antar konsentrasi. Berdasarkan hasil persen penghambatan ekspresi COX-2 pada masing-
masing konsentrasi ekstrak Milk Thistle tersebut, terlihat pada konsentrasi 2,5 menunjukan nilai yang paling besar yaitu 13,95 dibandingkan dengan kontrol
Biocream® dan ekstrak Milk Thistle konsentrasi 1,67 dan 3,75, namun secara PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
statistik ketiga konsentrasi tersebut dengan kontrol positif memiliki hubungan berbeda bemakna p 0,05 yang artinya ketiga konsentrasi tersebut dalam
menghambat ekspresi COX-2 aktifitasnya tidak sebanding atau lebih kecil dari kontrol positif. Konsentrasi ekstrak 1,67 dan 2,5 menunjukkan perbedaan
yang tidak bermakna, artinya kedua ekstrak tersebut berdasarkan statistik memiliki aktifitas yang sama, sehingga dapat dikatakan memiliki efek
penghambatan ekspresi COX-2 yang sebanding. Sedangkan ekstrak konsentrasi 2,5 dan 3,75 memiliki persen penghambatan ekspresi COX-2 yang lebih kecil
dibandingkan dengan ekstrak konsentrasi 2,5. Secara statistik memiliki hubungan yang berbeda bermakna, hal ini menunjukan bahwa aktifitas keduanya
tidak sama. Pada penelitian ini kontrol positif yang dipakai adalah hidrokortison
asetat 2,5 yang merupakan golongan kostikosteroid yang bekerja pada jalur posfolipase A2, namun pengujian ini menunjukkan bahwa kontrol positif dapat
juga menekan ekspresi COX-2. Berdasarkan Rang et al., 2007 golongan kortikosteroid dapat menghambat transkripsi gen pada siklooksigenase-2 COX-
2, yang diinduksi dalam sel inflamasi oleh mediator inflamasi. Profil rerata ekspresi protein COX-2 pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam setelah
injeksi karagenin 3 dapat dilihat pada gambar 11. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 11.Diagram penghambatan ekspresi COX-2 antar tiap kelompok perlakuan dan kontrol.
Berdasarkan diagram diatas, hasil uji statistik menunjukkan bahwa pada kontrol positif menunjukan hasil yang paling tinggi secara statistik dalam
menghambat ekspresi COX-2 yaitu 76,60. Dari ketiga konsentrasi yaitu 1,67; 2,5 dan 3,75 menunjukkan bahwa konsentrasi 2,5 hasilnya paling tinggi jika
dibandingkan dengan konsentrasi ekstrak Milk Thistle yang lain yaitu sebesar 13,96. Sedangkan pada kelompok perlakuan dengan konsentrasi 1,67 dan
konsentrasi 3,75 memiliki persen penekanan COX-2 sebesar 11,56 dan 8,48.
Dari hasil persen penekanan tersebut menunjukkan bahwa masing-masing kelompok perlakuan ekstrak Milk Thistle memiliki efek penekanan ekspresi COX-
2, namun secara statistik efek penekanannya tidak setinggi pada kelompok kontrol. Perhitungan sel yang mengekspresikan COX-2 ini dilakukan dengan
perhitungan langsung direct counting dengan mikroskopcahaya Olympus® untuk setiap lima bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali.
Senyawa flavonoid yang terkandung dalam Milk Thistle menunjukkan adanya aktivitas antiinflamsi. Flavonoid dapat menghambat eicosanoid yang
menghasilkan enzim mediator inflamasi. Sehinga, flavonoid dapat menghambat ekspresi dari COX-2 yang banyak diekspresikan pada jenis sel-sel peradangan
yang terkait termasuk makrofag dan sel mast Kim et al.,2004. Mekanisme flavonoid dalam penghambatan jalur arachidonic acid dengan menghambat
ekspresi dari mediator inflamasi yaitu COX-2. Penghambatan ini mengakibatkan terjadinya pengurangan jumlah prostaglandin khususnya mediator pro-inflamasi
seperti PGE2. Sehingga respon inflamasi tersebut akan berkurang Gomes et al., 2008.
Sifat anti-inflamasi yang dilakukan oleh flavonoid dibuktikan melalui berbagai tes pada molekul yang beragam dari kelas flavonoid yang berbeda, untuk
mengeksplorasi efek mereka pada berbagai jalur yang terlibat dalam proses inflamasi. Peran flavonoid dalam memodulasi ekspresi enzim COX-2 dan iNOS
ditunjukan pada gambar 12. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Gambar 12. Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktor-faktor
transkripsi seperti CREB, AP-1, NF-
κB, dan CEBP yang memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-
α, IL-1β, dan IL-6 Gomes, 2008.
Mekanisme aktivitas antiinflamasi senyawa flavonoid dengan cara menggangu aktivitas NF-
κB aktivator sehingga menghambat pengekspresian enzim COX-2. NF-
κB adalah salah satu faktor transkripsi dari empat faktor transkripsi yang telah diidentifikasi untuk mengikat cis-acting elemen di wilayah
promotor dan mengatur transkripsi enzim COX-2 Gomes, 2008. Hasil uji HE dan immunohistokimia penelitian tidak ada pengaruh
peningkatan konsentrasi ekstrak dengan efek antiinflamasi. Dapat dilihat dari hasil rerata penekanan ekspresi COX-2 konsentrasi 2,5 dan 3,75 justru mengalami
penurunan dan diantara ketiga konsentrasi ekstrak Milk Thistle secara statistik berbeda tidak bermakana. Hal tersebut menunjukan bahwa pada penelitian ini
tidak adanya pengaruh peningkatan konsentrasi ekstrak dengan efek antiinflamasi. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
Range konsentrasi yang dipakai diduga terlalu kecil sehingga tidak memperlihatkan pengaruh peningkatan efek antinflamasi dengan penekanan
migrasi sel neutrofil dan ekspresi COX-2 seiring dengan meningkatnya konsentrasi. Aktivitas antiinflamasi dari ekstrak Milk Thistle didukung melalui uji
antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle yang dilakukan secara makroskopik menggunakan metode Inflammation-assosiated. Pada penelitian tersebut
menggunakan parameter efek antiinflamasi berupa penurunan edema yang terbentuk setiap 1 jam selama 6 jam yang diukur dengan jangka sorong digital
Efariyanti, 2015. Hasil ekstrak Milk Thistle tidak menggunakan senyawa aktif tunggal
sehingga senyawa aktif lain yang terkandung di dalamnya dapat mempengaruhi hasil penelitian. Penelitian ini merupakan skrining awal untuk menunjukan
bahwatanaman Milk Thistle mempunyai efek antiinflamasi secara topikal. Hal tersebut membuktikan bahwa tanaman Milk Thistle adalah salah satu alternatif
yang dapat digunakan dalam pengobatan inflamasi baik oral maupun topikal. Maka diharapkan adanya penelitian lebih lanjut yang berkaitan untuk memastikan
senyawa aktif yang bertanggung jawab memberikan efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle.
59
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
