Hasil Pengujian Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Milk Thistle

adalah konsentrasi karagenin 3 karena pada konsentrasi karagenin 3 sudah menunjukan peningkatan tebal lipat kulit punggung mencit pada jam pertama yaitu lebih dari 2-3 kali dari lipat kulit awal dan tetap menunjukan edema lebih dari 2-3 kali dari lipat kulit awal selama enam jam pengamatan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Balian et al. 2006, konsentrasi karagenin yang digunakan pada uji efek antiinflamasi Milk Thistle diinduksi dengan karagenin 1. Namun dalam prapenelitian antiinflamasi ekstrak etanol buah Sylibum marianum L. apabila diberikan karagenin dengan konsentrasi 1, tidak menghasilkan edema yang diharapkan. Pada uji orientasi yang dilakukan, konsentrasi edema dinaikan menjadi 1,5; 2; dan 3, dan konsentrasi karagenin yang digunakan sebagai penginduksi inflamasi adalah karagenin dengan konsentrasi 3 karena dari hasil peningkatan tebal lipat kulit, konsentrasi 3 menunjukan peningkatan lebih dari 2-3 kali dari pengukuran awal.

C. Hasil Pengujian Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Milk Thistle

Terhadap Jumlah Sel Neutrofil Sebelum dilakukan pengujian efek antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle, maka terlebih dahulu bubuk ekstrak dibuat menjadi krim Milk Thistle menggunakan Biocream® sebagai basisnya sehingga dapat diaplikasikan secara topikal pada kulit punggung mencit. Ekstrak dibuat dalam seri konsentrasi yang berbeda yaitu 1,67; 2,5 dan 3,75. Pembuatan tiga seri konsentrasi ini bertujuan untuk melihat apakah pada setiap seri konsentrasi tersebut menunjukan adanya efek antiinflamasi topikal yang berbeda dan untuk mengetahui masing-masing PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI perbandingan khasiat dari ekstrak Milk Thistle terhadap kontrol sebagai antiinflamasi topikal. Pencukuran rambut pada bagian punggung mencit bertujuan untuk membersihkan tempat aplikasi tidak terdapat rambut halus agar mempermudah pembedahan kulit mencit. Setelah pencukuran mencit didiamkan selama satu hari yang betujuan untuk menghindari iritasi yang disebabkan selama proses pencukuran sehingga saat diinjeksikan dengan karagenan 3 secara subkutan, reaksi inflamasi yang terjadi murni disebabkan oleh induksi karagenan 3. Pada pengujian efek antiinflamasi topikal ekstrak Milk Thistle, menunjukkan terjadinya pengurangan jumlah sel-sel neutrofil pada bagian sub kutan kulit punggung mencit yang diinduksi karagenin 3 dan telah diberikan perlakuan ekstrak Milk Thistle secara topikal, dan dilihat pula pengurangan sel-sel neutrofil pada masing-masing kelompok perlakuan terhadap kelompok kontrol. Untuk mengetahui kemampuan ekstrak Milk Thistle dalam memberikan efek antiinflamasi yang dinyatakan dengan penurunan jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan dapat dilihat gambarannya dengan melakukan pengecatan hematoksilin eosin HE. Perhitungan migrasi sel neutrofil mengunakan perhitungan langsung direct counting dengan mikroskop binokuler Olympus® untuk setiap lima bidang pandang berbeda dengan perbesaran 400 kali. Reaksi inflamasi merupakan proses adanya reaksi pada pembuluh darah sehingga mengakibatkan eksudasi cairan dan protein plasma yang kemudian memicu terjadinya emigrasi leukosit dalam hal ini adalah neutrofil pada jaringan ekstravaskular yang dapat disebut sebagai edema Kumar dkk., 2005. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Data yang didapatkan merupakan jumlah dari sel neutrofil yang berada pada daerah subkutan di area terjadinya edema setelah 24 jam dari masing-masing kulit yang diberikan perlakuan, oleh sebab itu data tersebut digunakan untuk melihat aktifitas antiinflamasi. Sel neutrofil adalah sel darah putih pertama yang bermigrasi dari pembuluh ke daerah cedera yang dijumpai pada waktu tingkat akut atau awal inflamasi. Sel neutrofil ditarik ke daerah inflamasi oleh faktor kemotaktik, yang dihasilkan oleh bakteri, produk perombakan jaringan, faktor komplemen aktif dan faktor lainnya Tambayong, 2000. Neutrofil berupa sel bundar dengan diameter 12 µm, memiliki sitoplasma yang bergranula halus dan di tengah terdapat nukleus bersegmen. Neutrofil matang atau dewasa yang berada dalam peredaran darah perifer memiliki bentuk inti yang terdiri dari dua sampai lima segmen, sedangkan neutrofil yang belum matang neutrofil band akan memiliki bentuk inti seperti ladam kuda Schmeltzerand Norsworthy, 2012. Sel neutrofil mendominasi infiltrat peradangan selama 6 sampai 24 jam pertama, kemudian digantikan oleh monosit setelah 24 jam sampai 48 jam Kumar dkk., 2005. Hasil perhitungan sel neutrofil maka terlebih dahulu dihitung rata- rata dari setiap jumlah sel yang ada pada perlakuan. Profil pengecatan hematoksilin eosin HE dan rerata masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dapat dilihat pada gambar 7 dan tabel 1. Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan Milk Thistle konsentrasi 2,5 beserta kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit tanda lingkaran kuning Keterangan : 1. Kulit normal dengan perbesaran 100 kali 2. Kulit normal dengan perbesaran 400 kali 3. Kulit kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 100 kali 4. Kulit kontrol negatif karagenin dengan perbesaran 400 kali 5. Kulit Milk Thistle 2,5 dengan perbesaran 100 kali 6. Kulit Milk Thistle 2,5 dengan perbesaran 400 kali 1 2 3 4 6 6 5 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI Tabel 1. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan Kelompok Perlakuan Perlakuan Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE I Kontrol negatif 111,36 ± 6,98 II Kontrol Biocream® 109,32 ± 13,26 III Kontrol positif 67,68 ± 7,50 IV Milk Thistle1,67 77,84 ± 4,45 V Milk Thistle2,5 61,64 ± 7,26 VI Milk Thistle3,75 42,32 ± 3,45 Tabel diatas menunjukan hasil pengujian efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistle secara topikal pada setiap perlakuan hewan uji. Kelompok kontrol negatif, hewan uji hanya diinjeksikan karegenin menunjukkan rerata jumlah neutrofil pada daerah sub kutan yaitu 111,36 ± 6,98 dan pada perlakuan kontrol Biocream® rerata jumlah neutrofil yaitu 109,32 ± 13,26 masih tergolong jumlah yang cukup besar dibandingkan kelompok perlakuan yang lain. Hal ini menunjukan bahwa karagenin dapat menjadi penginduksi inflamasi yang ditandai terdapat peningkatan jumlah neutrofil pada daerah subkutan kulit punggung mencit. Inflamasi yang diinduksi oleh karagenin dapat digunakan sebagai model peradangan akut. Pada peneliti an ini digunakan tipe κ-karagenin yang merupakan polisakarida sulfat yang dapat menginduksi respon inflamasi dengan mengaktifkan respon imun. Adapun migrasi sel neutrofil merupakan respon dari inflamasi akut Wade, 2014. Berdasarkan pengamatan yang dilakukan secara mikroskopik, pada perlakuan sebagai kontrol positif dan perlakuan yang diberikan ekstrak Milk Thistle menunjukkan adanya pengurangan jumlah sel-sel neutrofil yang cukup berarti. Rerata jumlah sel neutrofil yang ditunjukan pada perlakuan kontrol positif hidrokortison asetat 2,5 yaitu 67,68 ± 7,50, sedangkan pada tiap perlakuan yang diberikan ekstrak dengan pemberian konsentrasi 1,67 rerata yang didapatkan 77,84 ± 4,45. Hasil rerata pada konsentrasi 1,67 menujukan ekstrak Milk Thistle mampu menghambat terjadinya edema dan pengurangan jumlah sel neutrofil yang bermigrasi pada daerah sub kutan, walaupun aktivitas penghambatannya tidak tinggi jika dibandingkan dengan kontrol positif. Profil rerata jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah subkutan pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3 dapat dilihat pada gambar 8. Gambar 8.Diagram batang aktivitas sel neutrofil pada mencit setelah pemberian ekstrak Milk Thistle secara topikal. Berdasarkan diagram diatas, profil kurva kontrol negatif dan kontrol Biocream® memiliki migrasi jumlah neutrofil pada daerah subkutan paling besar dibanding dengan kelompok lainnya. Hal ini menunjukan bahwa karagenin merupakan zat inflamatogen yang dibuktikan dengan peningkatan jumlah sel neutrofil di daerah subkutan. Basis yang digunakan untuk ekstrak Milk Thistle tidak memiliki efek dalam menurunkan migrasi sel neutrofil yang ditunjukan dari profil garis kurvanya hampir mirip dengan garis kurva kontrol negatif. Pada penelitian ini kontrol positif yang diberikan adalah hidrokortison asetat 2,5, yang termasuk kedalam golongan obat kortikosteroid. Memiliki mekanisme menghambat pembentukan interleukin, tumor nekrosis faktor TNF dan menurunkan permeabilitas kapiler. Selain itu kortikosteroid bekerja dengan cara mencegah reaksi alergi, mengurangi peradangan, dan menghambat sel epidermis Dipiro, 2008. Kortikosteroid merupakan antiinflamasi yang identik dengan kortisol, hormon steroid pada manusia yang disentesis dan di ekskresi oleh korteks adrenal. Efek dari antiinflamasi kortikosteroid mempengaruhi berbagai sel imunokompeten seperti sel T, makrofag, sel dendritic, eosinophil, neutrophil, dan sel mast, dengan cara menghambat respons inflamasi yang menyebabkan apoptosis Mycek, 2001. Hasil perhitungan jumlah neutrofil antar kelompok dianalisis menggunakan uji Shapiro-Wilk untuk menentukan kenormalan data yang diperoleh. Uji Shapiro- Wilk menunjukan bahwa data terdistribusi normal dengan nilai p setiap kelompok lebih besar dari p=0,05. Dilanjutkan dengan uji Anova karena data yang didapatkan terdistribusi secara normal. Kemudian dilakukan uji Scheffe untuk PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI melihat perbedaan bermakna atau tidak antar tiap kelompok perlakuan. Hasil uji Scheffe setiap kelompok perlakuan dapat dilihat pada tabel 2. Tabel 2.Hasil uji Scheffe aktivitas sel neutrofil pada mencit setelah pemberian ekstrak Milk Thistle secara topikal. I II III IV V VI Rerata Jumlah sel neutrofil ± SE I BTB BB BTB BB BB 111,36 ± 6,98 II BTB BB BTB BB BB 109,32 ± 13,26 III BB BB BTB BTB BTB 67,68 ± 7,50 IV BB BTB BTB BTB BTB 77,84 ± 4,45 V BB BB BTB BTB BTB 61,64 ± 7,26 VI BB BB BTB BTB BTB 42,32 ± 3,45 Keterangan : I : Kontrol negatif Karagenin 3 II : Kontrol Biocream ® III : Kontrol positif Hidrokortison asetat 2,5 IV : Ekstrak Milk Thistle 1,67 V : Ekstrak Milk Thistle 2,5 VI : Ekstrak Milk Thistle 3,75 BB : Berbeda bermakna p 0,05 BTB : Berbeda tidak bermakna p 0,05 SE : Standart error Berdasarkan tabel diatas dapat dilihat bahwa pengurangan jumlah migrasi neutrofil pada daerah subkutan secara statistik dari hasil pemberian ekstrak Milk Thistle konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75 terhadap kontrol negatif, kontrol positif dan kontrol biocream ® . Rerata sel neutrofil kelompok karagenin PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI 3 berbeda tidak bermakna dengan rerata sel neutrofil kelompok Biocream®. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok Biocream® tidak memiliki efek antiinflamasi. Rerata sel neutrofil kelompok karagenin 3berbeda bermakna dengan kelompok kontrol positif dan ketiga kelompok konsentrasi ekstrak Milk Thistle. Hasil ini menunjukan bahwa kelompok karagenin 3 pada penelitian ini bertindak sebagai agen inflamatogen yang menginduksi mediator inflamasi. Sedangkan rerata kontrol negatif dengan kontrol positif Hidrokortison asetat 2,5 mempunyai hubungan yang berbeda bermakna p0,05. Hirokortison secara statistik mampu menurunkan jumlah sel neutrofil yang bermigrasi. Hal tersebut menunjukan bahwa aktifitas keduanya tidak sama. Pada rerata ekstrak Milk Thistle konsentrasi 1,67; 2,5 dan 3,75 masing- masing menunjukkan adanya perbedaan yang berbeda bermakna p 0,05 dengan kontrol negatif induksi karagenin dan kontrol biocream®. Hal ini menunjukan bahwa ketiga konsentrasi tersebut aktifitasnya tidak sama dengan kontrol negatif dan biocream ® . Secara statistik menunjukan bahwa ekstrak Milk Thistle dengan konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75 mempunyai efek penghambatan migrasi sel neutrofil pada daerah sub kutan, namun rerata ketiga konsentrasi tersebut dengan kontrol positif hidrokortison asetat 2,5 memiliki hubungan berbeda tidak bermakna p 0,05 dapat dikatakan bahwa aktifitas ketiga konsentrasi ekstrak Milk Thistle sebanding dengan kontrol positif hidrokortison asetat 2,5. Rerata sel neutrofil ekstrak Milk Thistle 1,67 lebih besar dibandingkan dengan 2,5. Dapat diartikan bahwa ekstrak Milk Thistle 2,5 efek penurunan sel neutrofil lebih besar dari 1,67. Ekstrak Milk Thistle 3,75 PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI mempunyai rerata yang paling kecil yang menunjukan pada konsentrasi ini efek penurunan sel neutrofilnya paling besar jika dibandingkan dengan konsentrasi lainnya. Namun secara statistik ketiga konsentrasi berbeda tidak bermakna. Hal ini menunjukan bahwa dari ketiga ekstrak tersebut memiliki efek penurunan sel neutrofil yang sama menurut statistik. Berdasarkan penelitian Hadaruga et al., 2009 kandungan pada ekstrak buah Milk Thistle antara lain 65-85 flavonolignans silymarin seperti silychristin, isosilychristin, silydianin, silybin A dan B, isosilybin A dan B, dan juga 20-35 asam lemak, flavonoid, stimulan metabolik dan polifenol lainnya. Selain mengandung flavolignans silymarin tanaman Milk Thistle juga mengandung tyramine, histamine, asam linoleat gamma, dan minyak esensial. Senyawa flavonoid memiliki aktivitas antioksidan dalam menangkap radikal bebas sehingga memiliki efek antiinflamasi. Senyawa tersebut juga dapat mengatur aktivitas regulasi seluler dari sel-sel peradangan seperti, sel mast, makrofag, limfosit dan neutrofil. Flavonoid juga dapat menghambat degranulasi neutrofil, dan juga mengurangi pelepasan asam arakidonat oleh neutrofil dan sel- sel mediator inflamasi lainnya. Sehingga dapat mengurangi eksudat dan jumlah migrasi leukosit Kim et al., 2004.

D. Hasil Persen Penghambatan Ekspresi COX-2 Ekstrak Milk Thistle