Uji efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun majapait (Crescentia cujete L.) terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase 2 pada mencit terinduksi karagenin.

INTISARI

Tanaman majapait (Crescentia cujete L.) merupakan salah satu tanaman berkhasiat obat. Dari penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, hasil uji in-vitro

ekstrak etanol daun majapait memberikan aktifitas antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiinflamasi topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi topikal dari ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss yang diinduksi dengan karagenin 3% secara subkutan.

Penelitian ini termasuk eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak pola searah. Tiga puluh ekor mencit betina dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol Biocream®, kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% dengan cara pemberian secara topikal. Pemotongan kulit hewan uji dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan. Kulit hewan uji diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Sel neutrofil yang bermigrasi di daerah subkutan diamati menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dilanjutkan dengan uji persen penekanan ekspresi siklooksigenase (COX) 2 dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2. Data yang diperoleh berupa dianalisis mengunakan uji Shapiro Wilk, dilanjutkan uji nonparametrik Kruskal Wallis dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney pada taraf kepercayaan 95%.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel neutrofil yang bermigrasi pada kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% berturut-turut adalah 31,20; 26,36 dan 16,76 lebih kecil dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 111,36. Dan pada konsentrasi yang sama memberikan persen (%) penekanan ekspresi COX-2 berturut-turut adalah 8,33; 13, 44; dan 14,13 lebih besar dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 1,45. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol daun majapait menunjukan aktifitas antiinflamasi pada pemberian topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi diduga melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2.

ii ABSTRACT

Majapait (Crescentia cujete L.)is a plant that has pharmacological effect. From the previous study in-vitro test that the leaves ethanol extract of C. cujete

possessed inflammatory. The research aims is to investigate topical anti-inflammation effect and mechanism of action of Crescentia cujete leaves ethanolic extract in female mice strains Swiss induced by carrageenan 3% subcutaneously.

The study was pure experimental with completely randomized design direction. Thirty mice were devided into six groups of five animal each. Negatif control group, positif control group, Biocream® control group and group of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete with a consentration of 1.67; 2.5; and 3.75% were given topically. Cutting animal skin test performed for 24 hours. Skin test animals preserved using a fixative solution, 10% formalin solution. The neutrophils migration was observed using Hematoxylin and Eosin (HE) Staining Method. And than Immunohistochemical Method using antibody anti cyclooxygenase-2’s observed suppress the expression of cyclooxygenase 2 (COX-2). These data were analyzed using Shapiro-Wilk test, continued byKruskal–Wallis test and Post Hoc test by Mann Whitneytest with 95% confidence level.

The result showed that neutrophils migrating of leaves ethanolic extractof

Crescentia cujete at consentration 1.67; 2.5; and 3.75%, respectively, 8.33; 13. 44; and 14.13. They are lower than carrageenan control group at 111.36. And at the same concentration showed that suppression expression of cyclooxygenase-2 (in %), respectively, 8.33; 13.44; and 14.13. They are higher than carrageenan control group at 1.45%. In conclusion, leaves ethanol extract of Crescentia cujete has topical antiinflammatory effect. Inhibiton of neutrophil migration and suppressthe expression of cyclooxygenase-2 are alleged this mechanism of antiinflammatory. Keywords : antiinflammatory, topical, Crescentia cujete, neutrophils,

UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN MAJAPAIT (Crescentia cujete L.)TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI

KARAGENIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh : Dui Sostales NIM : 128114085

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

i

UJI EFEK ANTIINFLAMASI TOPIKAL EKSTRAK ETANOL DAUN MAJAPAIT (Crescentia cujete L.)TERHADAP JUMLAH NEUTROFIL DAN EKSPRESI SIKLOOKSIGENASE 2 PADA MENCIT TERINDUKSI

KARAGENIN

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh : Dui Sostales NIM : 128114085

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

“Our greatest weakness lies in giving up. The most certain way to succeed is always to try just one more time”

-Thomas Alva

Edison-Takut akan TUHAN adalah permulaan pengetahuan, tetapi

orang bodoh menghina hikmat dan didikan

(Amsal 1:7)

Kupersembahkan buat : Kemulian Tuhan Yesus Kristus sebagai juruselamat hidupku Kedua orang tuaku dan saudariku tercinta

vii PRAKATA

Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus oleh karena berkat dan rahmat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Efek Antiinflamasi Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (Crescentia cujete L.) terhadap Jumlah Neutrofil dan Ekspresi Siklooksigenase 2 pada Mencit Terinduksi Karagenin” dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat dalam memperoleh gelar Serjana farmasi (S.Farm.) Fakultas Faramasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Penyelesaiaan skripsi ini tidak lepas dari dukungan dan bantuan dari berbagai pihak, baik secara langsung maupun secara tidak langsung. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih banyak kepada :

1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta

2. Bapak Enade Perdana Istyatono, Ph.D.,Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, dan dukungan selama menjalani proses perkuliahan di Fakultas Farmasi hingga saat ini. 3. Ibu drh. Sitarina Widyarini, M.P.,Ph.D., selaku Pembimbing Utama atas

kesabaran dan ketabahan untuk selalu membimbing, menyemangati, membantu, dan mengarahkan selama proses penelitian hingga penyusunan skripsi ini.

4. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Pembimbing Pendamping atas dukungan, bimbingan, dan masukan selama proses penelitian hingga penyusunan skripsi ini.

viii

5. Ibu Phebe Hendra, M.Si.,Ph.D.,Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. 6. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si., selaku Dosen Penguji yang telah

memberikan saran dan kritik yang membagun hingga skripsi ini tersusun. 7. Bapak, Ibu, Kak Dea yang selalu memberikan doa, dukungan, semangat,

bantuan, dan kasih sayang.

8. Ibu Agustina Setiawati, M.Sc.,Apt. selaku Kepala Laboratorium Fakultas Farmasi yang telah memberikan izin dalam penggunaan semua fasilitas laboratorium yang mendukung dalam penelitian ini.

9. Staf laboratorium, Bapak Heru, Bapak Purwanto, Bapak Wagiran, Bapak Suparjiman, Bapak Kayatno, dan Bapak Lilik yang telah membantu dalam proses penelitian di laboratorium.

10. Teman-teman seperjuangan dalam penelitian : Monika, Ruri, Kathrin, Farra, Sinta, atas bantuan, kerja sama, perjuangan serta suka duka yang dialami selama penelitian.

11. Penghuni kontrakan Dangau Kamuda Diri (DKD) : Bang Egi, Om Alim, Vensi, Sambu, Iwan, serta Taufik yang selalu ada dikontrakan untuk mendukung, menyemangati, membantu dan memberi masukan kepada penulis dalam menyusun skripsi.

12. Teman-teman FSM B dan FST A 2012 atas kebersamaan, suka duka selama menempuh pendidikan di Falkutas Farmasi.

13. Teman-teman team dota : Andrew, Daniel, Aris, Gotaro, Maco, dan Rei atas saran dan mainnya selama penyusunan skripsi ini.

ix

14. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan dalam penyusunan skripsi ini. Maka penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Akhir kata, semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Yogyakarta, Januari 2016

Penulis

x DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ……….. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ……… ii

HALAMAN PENGESAHAN ……… iii

HALAMAN PERSEMBAHAN ………. iv

SURAT PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS ... v

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ………. vi

PRAKATA ………. vii

DAFTAR ISI ……….. x

DAFTAR TABEL ……….. xiii

DAFTAR GAMBAR ………. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ……….. xvi

INTISARI ……….. xviii

ABSTRACT ... xix

BAB I. PENGANTAR ……… 1

A. Latar Belakang ………. 1

1. Rumusan Masalah ……….. 5

2. Keaslian Penelitian ………. 6

3. Manfaat Penelitian ……….. 7

B. Tujuan Penelitian ……….. 8

xi

A. Tanaman Cresc3ntia cujete L. ... 9

B. Metode Penyarian ..………... 13

C. Kulit ...………... 14

D. Inflamasi ...………... 16

E. Antiinflamasi …...………. 20

F. Sistem Imun...………... 22

G. Flavonoid ... 23

H. Hematoksilin dan Eosin ... 24

I. Imunohistokimia ... 25

J. Karagenin ...……….. 26

K. Hidrokortison ...……… 27

L. Landasan Teori ………. 27

M. Hipotesis ……… 29

BAB III. METODE PENELITIAN ……… 30

A. Jenis dan Rancangan penelitian ……… 30

B. Variael dan Definisi Operasional ………. 30

C. Bahan Penelitian ……… 32

D. Alat Penelitian ……….. 33

E. Tata Cara Penelitian ………. 35

F. Teknik Analisis Data ...……… 39

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ……… 41

A. Hasil Determinasi Tanaman ………... 41

xii

C. Uji Pendahuluan …...……… 43

D. Pengujian Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete.... 45

E. Metode pengecatan hematoksilin eosin (HE)... 46

F. Metode Immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 ... 55

G. Mekanisme Efek Antiinflamasi Ekstrak Etanol Daun Majapait... 64

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ……… 68

A. Kesimpulan ………... 68

B. Saran ………. 68

DAFTAR PUSTAKA ……… 69

LAMPIRAN ……….. 74

xiii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil rerata jumlah sel neutrofil pada setiap kelompok perlakuan ... 49 Tabel II. Rerata jumlah sel neutrofil masing-masing kelompok

perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney ... 52 Tabel III. Rerata ekspresi enzim COX-2 (dalam %) oleh e ekstrak etanol

daun maja dengan kontrol pada daerah subkutan diinduksi karagenin 3%... 58 Tabel IV. Rerata penekanan ekspresi enzim COX-2 (dalam %)

masing-masing kelompok perlakuan dan kontrol dengan uji Mann Whitney... 61

xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescantia cujete L...………… 9 Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal. ………...………… 16 Gambar 3. Karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis... 17 Gambar 4. Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan

jalur lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi …... 21 Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid... 23

Gambar 6. Kurva peningkatan tebal lipat kulit selama enam jam. ….... 44 Gambar 7. Mikrofotografi pengecatan HE kulit normal, perlakuan

ekstrak etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan kulit (tanda lingkaran merah)... 48 Gambar 8. Diagram batang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol

daun maja masing-masing perlakuan dan kontrol ……… 50 Gambar 9. Mikrofotografi pengecatan immunositokimia terhadap

COX-2 pada sel neutrofil (tanda lingkaran merah) di daerah subkutan jaringan kulit mencit di bawah mikroskop binokuler pada perbesaran 100 kali (a) dan 400 kali (b). Tanda panah hitam menunjukkan hasil positif COX-2, tanda panah kuning menunjukkan hasil negatif COX-2... 56 Gambar 10. Mikrofotografi pengecatan Immunohistokimia dengan

xv

antibodi anti-COX-2 kulit normal, perlakuan ekstrak etanol daun maja konsentrasi 2,5% beserta kontrol negatif (karagenin) dengan perbesaran 100 kali dan 400 kali. Migrasi sel neutrofil terlihat pada daerah subkutan jaringan

kulit (tanda lingkaran merah). ………... 57

Gambar 11. Diagram batang ekspresi enzim COX-2 masing-masing kelompok perlakuan beserta kontrol... 59

Gambar 12. Target flavonoid dalam memodulasi respon inflamasi melalui jalur asam arakidonat dan protein kinase yang mengatur faktor-faktor transkripsi seperti CREB, AP-1, NF- B, dan C/EBP yang memodulasi ekspresi penanda pro-inflamasi seperti COX-2, iNOS, TNF-α, IL-1β, dan IL6... 65

Gambar 13. Daun Crescantia cujete……… 76

Gambar 14. Serbuk daun Crescantia cujete……….. 76

Gambar 15. Ekstrak kental etanol daun Crescantia cujete ………... 76

Gambar 16. Mencit betina galur Swiss... 77

Gambar 17. Kulit punggung mencit setelah pencukuran.………. 77

Gambar 18. Pengawetan kulit dengan formalin 10%…………... 77

Gambar 19. Kontrol Biocream sebagai basis ekstrak ………... 78

Gambar 20. Kontrol Hidrocortisone sebagai kontrol positif... 78

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat keterangan hasil determinasi tanaman majapait

(Crescentia cujete L)... 74

Lampiran 2. Serbuk daun Crescentia cujete beserta ekstrak etanol Crescentia cujete ... 76

Lampiran 3. Hewan uji yang digunakan beserta pengawetan kulit... 77

Lampiran 4. Kontrol yang digunakan beserta alat spuit injeksi ………... 78

Lampiran 5. Surat Etical Clirens……… 79

Lampiran 6. Hasil perhitungan migrasi sel neutrofil pada uji hematoksilin eosin (HE) ... 80

Lampiran 7. Hasil uji normalitas migrasi sel neutrofil dengan uji Shapiro Wilk ………... 82

Lampiran 8. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Kruskal-Wallis... 83

Lampiran 9. Hasil pengujian migrasi sel neutrofil dengan Mann-Whitney... 86

Lampiran 10. Hasil perhitungan sel ekpresi enzim COX-2 pada uji imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2... 94

Lampiran 11. Persen penekanan ekpresi enzim COX-2 pada uji imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2... 96

Lampiran 12. Hasil uji normalitas persen penekanan enzim COX-2 dengan uji Shapiro Wilk ... 98

xvii

Lampiran 13. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan Kruskal-Wallis... 101 Lampiran 14. Hasil pengujian persen penekanan enzim COX-2 dengan

xviii INTISARI

Tanaman majapait (Crescentia cujete L.) merupakan salah satu tanaman berkhasiat obat. Dari penelitian yang telah dilakukan sebelumnya, hasil uji in-vitro ekstrak etanol daun majapait memberikan aktifitas antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek antiinflamasi topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi topikal dari ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss yang diinduksi dengan karagenin 3% secara subkutan.

Penelitian ini termasuk eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak pola searah. Tiga puluh ekor mencit betina dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif, kelompok kontrol Biocream®, kelompok kontrol positif, kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% dengan cara pemberian secara topikal. Pemotongan kulit hewan uji dilakukan pada 24 jam setelah perlakuan. Kulit hewan uji diawetkan mengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10%. Sel neutrofil yang bermigrasi di daerah subkutan diamati menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan dilanjutkan dengan uji persen penekanan ekspresi siklooksigenase (COX) 2 dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2. Data yang diperoleh berupa dianalisis mengunakan uji

Shapiro Wilk, dilanjutkan uji nonparametrik Kruskal Wallis dengan Post Hoc Test menggunakan uji Mann Whitney pada taraf kepercayaan 95%.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa sel neutrofil yang bermigrasi pada kelompok perlakuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada konsentrasi 1,67; 2,5; dan 3,75% berturut-turut adalah 31,20; 26,36 dan 16,76 lebih kecil dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 111,36. Dan pada konsentrasi yang sama memberikan persen (%) penekanan ekspresi COX-2 berturut-turut adalah 8,33; 13, 44; dan 14,13 lebih besar dibandingkan dengan kontrol karagenin, yaitu 1,45. Kesimpulan dari penelitian ini adalah ekstrak etanol daun majapait menunjukan aktifitas antiinflamasi pada pemberian topikal dan mekanisme aktifitas antiinflamasi diduga melalui penghambatan migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2.

xix ABSTRACT

Majapait (Crescentia cujete L.)is a plant that has pharmacological effect. From the previous study in-vitro test that the leaves ethanol extract of C. cujete

possessed inflammatory. The research aims is to investigate topical anti-inflammation effect and mechanism of action of Crescentia cujete leaves ethanolic extract in female mice strains Swiss induced by carrageenan 3% subcutaneously.

The study was pure experimental with completely randomized design direction. Thirty mice were devided into six groups of five animal each. Negatif control group, positif control group, Biocream® control group and group of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete with a consentration of 1.67; 2.5; and 3.75% were given topically. Cutting animal skin test performed for 24 hours. Skin test animals preserved using a fixative solution, 10% formalin solution. The neutrophils migration was observed using Hematoxylin and Eosin (HE) Staining Method. And than Immunohistochemical Method using antibody anti cyclooxygenase-2’s observed suppress the expression of cyclooxygenase 2 (COX-2). These data were analyzed using Shapiro-Wilk test, continued byKruskal– Wallis test and Post Hoc test by Mann Whitneytest with 95% confidence level.

The result showed that neutrophils migrating of leaves ethanolic extract of Crescentia cujete at consentration 1.67; 2.5; and 3.75%, respectively, 8.33; 13. 44; and 14.13. They are lower than carrageenan control group at 111.36. And at the same concentration showed that suppression expression of cyclooxygenase-2 (in %), respectively, 8.33; 13.44; and 14.13. They are higher than carrageenan control group at 1.45%. In conclusion, leaves ethanol extract of Crescentia cujete

has topical antiinflammatory effect. Inhibiton of neutrophil migration and suppressthe expression of cyclooxygenase-2 are alleged this mechanism of antiinflammatory.

Keywords : antiinflammatory, topical, Crescentia cujete, neutrophils, cyclooxygenase

1

BAB I PENGANTAR

A. LATAR BELAKANG

Keanekaragaman hayati (biodiversity) yang dimiliki Indonesia, baik tumbuhan tropis dan biota lautnya, menduduki peringkat kedua di dunia setelah Brazil. Sekitar 30.000 jenis tumbuhan dan 7.000 di antaranya ditengarai memiliki khasiat sebagai obat. Kekayaan keanekaragaman hayati ini diteliti, dikembangkan dan dimanfaatkan untuk peningkatan kesehatan maupun tujuan ekonomi dengan tetap menjaga kelestariannya ( Sampurno, 2015).

Tumbuhan berkhasiat obat atau herbal medicine merupakan produk obat yang berasal dari bagian akar, batang, daun, kulit batang, biji, buah dan bunga yang digunakan untuk pencegahan dan atau penyembuhan penyakit (Kamboj, 2000). Dewasa ini penggunaan obat herbal cenderung terus meningkat, baik di negara-negara berkembang maupun di negara-negara maju. Peningkatan penggunaan obat herbal ini terkait kompatibilitas yang lebih baik dengan tubuh manusia dan efek samping yang lebih rendah.

Salah satu tumbuhan yang berkhasiat obat adalah tumbuhan majapait (Crescentia cujete L.) yang tumbuh subur di daerah tropis Indonesia. Tumbuhan majapait atau disebut juga dengan maja atau berenuk merupakan tanaman perdu yang termasuk dalam famili Bignoniaceae. Tumbuhan majapait sudah dimanfaatkan sebagai obat pencuci perut, pencahar dan ekspektoran. Selain itu juga digunakan sebagai obat cacing, analgesik, antiinflamasi dan obat penurun

panas. Kayunya digunakan untuk pengobatan demam dan sakit telinga sedangkan daun digunakan untuk menurunkan tekanan darah. Tanaman ini sudah digunakan sebagai pencahar oleh masyarakat di Kosta Rika, sedangkan di Kolombia digunakan untuk penderitaan gangguan pernapasan (Khan, 2015).

Konstituen fitokimia tanaman majapait dilaporkan oleh Mahbub, Hoq, Ahmed, dan Sarker (2011) terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina,

estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin,

naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Dalam penelitian yang dilakukan Das, Islam, Jahan, Saiful, Khan, Rafikul, dan Parvin (2014) melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Ejelonu, Lasisi, Olaremu, dan Ejelonu (2011) juga melaporkan kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol, tannins, saponins, alkaloids, flavonoid, anthraquinone, cardenolides, phiobatannin.

Proses inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai respon normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen mikrobiologi. Respon tersebut penting untuk memungkinkan tubuh bertahan selama infeksi atau cedera dan mempertahankan homeostasis jaringan saat kondisi berbahaya. Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan) (Corwin, 2008). Respon inflamasi biasanya disertai dengan rasa tidak nyaman, sehingga mendorong penderita untuk segera mengatasi dan mengobati inflamasi yang terjadi.

Setiap agen atau obat yang bekerja melawan atau menekan proses peradangan disebut antiinflamasi (Dorlan, 2002). Obat antiinflamasi dapat digunakan secara oral maupun topikal. Pada penggunaan topikal, antiinflamasi dioleskan pada daerah yang mengalami inflamasi. Penggunaan anttiinflamasi topikal semakin banyak dicari terkait keuntungan penggunaan sediaan topikal yang dapat mempercepat aksi obat ditempat kerja karena tidak melalui sistem percernaan dan menghindari rusaknya zat aktif disebabkan oleh aktifitas enzim dan interaksi dengan makanan pada terapi antiinflamasi secara oral (Ansel, 1989).

Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan respon imum melalui metabolisme asam arakidonat (Widiastuti, 2011). Protein COX yang merupakan target aksi Obat Anti Inflamasi Non Steroid (OAINS) terdapat dalam dua isoform, yaitu COX-1 dan COX-2. COX-1 bersifat konstitutif, diekspresikan pada hampir semua jaringan untuk fisiologi normal dan homeostasis, sedangkan ekspresi COX-2 terinduksi oleh berbagai stimulus inflamasi dan bertanggung jawab pada biosintesis PG yang terlibat pada reaksi inflamasi dan rasa nyeri (Ikawati, 2006). Sementara ini dapat disimpulkan bahwa aktivitas COX-2, bukan COX-1, memainkan peranan penting dalam proses inflamasi.

Fase seluler awal proses inflamasi ditandai dengan migrasi sel neutrofil polimorfonuklear (PMN), sel leukosit pertama, yang secara kimia tertarik ke daerah inflamasi. PMN neutrofil muncul dalam jumlah yang besar pada hari-hari pertama peradangan. Banyaknya PMN neutrofil tersebut disebabkan karena

adanya peningkatan permeabilitas vaskular dan vasodilatasi pada proses peradangan. Penghambatan migrasi sel neutrofil menjadi salah satu kunci menghambat terjadinya inflamasi. Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara langsung menghambat pelepasan asam arakidonat yang menyebabkan kurang tersedianya substart arakidonat bagi jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin (Rahayu, 2009). Mengingat besarnya peran sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, maka keduanya dapat dijadikan sebagai target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang berperan sebagai agen yang mempengaruhi migrasi sel neutrofil dan regulasi protein COX-2, melalui penekanan ekspresi protein COX-2.

Hasil uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell)

dengan membrane stabilization menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi. Aktifitas antiinflamasi pada ekstrak daun majapait diyakini berasal senyawa flavanoid serta tanin. Flavonoid seperti quercetin yang diketahui efektif dalam mengurangi peradangan akut. Adapun efek antiinflamasi dari senyawa flavonoid tertentu bekerja melalui penghambatan kuat terhadap berbagai enzim seperti proteinkinase C, protein kinase tirosin, fosfolipase A2, fosfodiesterase (Parvin et al.,2015).

Kusuma, Sulistyo, Susanti, dan Sabikis (2014) melaporkan bahwa pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada konsentrasi 40; 60; dan 80% memberikan aktifitas penghentian pendarahan luar yang lebih baik dibandingkan kontrol. Flavonoid serta tanin yang terkandung pada ekstrak etanol daun majapait diduga berperan dalam penghambatan sintesis lokal dan produksi

dari prostaglandin I2 vasodilatasi (prostasiklin) sehingga menyebabkan proses kontraksi luka (vasokontriksi) menjadi lebih cepat.

Das et al. (2014) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC tests. Senyawa antioksidan seperti phenol dan flavonoids

mengikat radikal bebas sehingga menghambat mekanisme oksidatif yang menyebabkan penyakit degeneratif dan lainnya. Aktifitas antioksidan telah memiliki peran sangat penting dalam pengobatan penyakit akibat terpapar radikal bebas, seperti kanker, penyakit jantung, diabetes, inflamasi, penyakit degeneratif, anemia, penuaan, dan iskemia. Adanya aktifitas antiinflamasi senyawa antioksidan dari uji in-vitro ekstrak etanol daun majapait memberikan peluang bagi penggunaan ekstrak etanol daun majapait secara topikal. Penelusuran mengenai mekanisme aktivitas antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait perlu dilakukan lebih lanjut melalui perhitungan jumlah neutrofil menggunakan metode hematoksilin dan eosin (HE) dan penekanan ekspresi protein COX-2 menggunakan metode imunohistokimia. Penelitian efek antiinflamasi topikal ektrak etanol daun majapait (Crescentia cujete L.) dilakukan dengan pengujian terhadap kulit punggung mencit galur Swiss yang diinduksi karagenan 3%.

1. Rumusan masalah

a. Apakah ekstrak etanol daun tumbuhan Crescentia cujete L. memiliki efek antiinflamasi topikal terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase 2 pada mencit galur Swiss ?

b. Bagaimana mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun

Crescentia cujete L. pada mencit galur Swiss yang diinduksi karagenin 3% ?

2. Keaslian penelitian

Penelitian mengenai majapait yang pernah dilakukan antara lain:

a. Penelitian yang dilakaukan Mahbub et al. (2011) melaporkan kandungan kimia tanaman majapait, yaitu tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta

amirina, estearic acid, triacontanol, palmitic acid, flavonoids-quercetin,

apigenin, naphthoquinones, iridoids glycosides, 3-hydroxybutanal

glycosides.

b. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa

steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. c. Penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) juga melaporkan bahwa

ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC

tests. Penelitian yang dilakukan Kusuma dkk. (2014) juga melaporkan bahwa pengujian ekstrak etanol daun majapait secara in-vivo pada konsentrasi 40; 60; dan 80% memberikan aktifitas penghentian pendarahan luar yang lebih baik dibandingkan kontrol.

d. Penelitian yang dilakukan Parvin et al.(2015) melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi pada uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell) dengan membrane stabilization.

Sejauh pengamatan penulis, penelitian tentang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi COX-2 pada mencit yang diinduksi karagenin 3% melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit dengan pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) belum pernah dilaporkan.

3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan mampu memberikan informasi dan bukti ilmiah tentang penggunaan ekstrak etanol daun majapait sebagai antiinflamasi topikal melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit dengan pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dan imunohistokimia dengan antibodi anti-siklooksigenase-2 (COX-2) .

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi bahwa tumbuhan majapait merupakan bahan obat dengan aktifitas antiinflamasi, sehingga dapat mendukung penggunaan dan pengembangan tanaman majapait sebagai antiinflamasi topikal.

B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum

Penelitian ini bertujuan untuk menguji efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia cujete L.

2. Tujuan Khusus

a. Mengetahui efek antiinflamasi topikal ektrak etanol daun Crescentia cujete L. terhadap jumlah neutrofil dan ekspresi siklooksigenase 2 pada mencit galur Swiss.

b. Mengetahui mekanisme aktifitas antiinflamasi ekstrak etanol daun

Crescentia cujete L. pada mencit galur Swiss yang diinduksi karagenin 3%.

9 BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Crescentia cujete L.

Gambar 1. Tanaman dan Daun Crescentia cujete L.

1. Taksonomi tanaman

Kingdom : Plantae (Tumbuhan) Subkingdom : Viridiplantae Infrakingdom : Streptophyta Divisi : Tracheophyta Sub Divisi : Spermatophytina Classs : Magnoliopsida Superorder : Asteranae Ordo : Lamiales Famili : Bignoniaceae

Genus : Crescentia

Spesies : Crescentia cujete L. ( Anonim, 2015).

2. Sinonim

Calabash Ayale, Calabacero, Miracle fruit, Vilayati Bel, Beggars bowl

(Khan, 2015).

3. Nama daerah

Sumatera : Tabu kayu (Melayu) Jawa : Berenuk (Jawa)

Sulawesi : Bila balanda (Makasar), Maluku : Buah no (Ternate)

Indonesia : Majapait

(Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).

4. Penyebaran

Crescentia cujete L. (Gambar 1.) merupakan tanaman yang banyak dijumpai di daerah tropis. Distribusikan secara luas di kawasan Karibia, Meksiko, Utara dan Selatan Amerika, Asia, Malesia dan kemudian diperkenalkan ke Afrika, dari Senegal ke Kamerun kemudian ke bagian lain dari Afrika. Pohon ini banyak ditanam di bagian utara negara Nigeria (Ejelonu et al., 2011).

Tanaman ini merupakan jenis tanaman dikotil berbunga yang berasal dari Amerika Tengah dan Selatan. Tanaman ini dapat hidup dengan baik di

tempat-tempat yang terbuka dan kena sinar matahari langsung, baik di dataran rendah maupun dataran tinggi, yakni pada ketinggian 1 – 1.400 m di atas permukaan laut. Ditanam di tempat yang agak ternaung atau sedikit terlindungi pun masih dapat juga berbunga dan berbuah. Untuk mendapatkan tanaman yang sehat, media tanam atau lahan yang akan ditanami harus subur, gembur dan drainase diatur dengan baik (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).

5. Morfologi

Pohon majapait tumbuh hingga 6-10 m, daun hijau terang, panjang 5 sampai 15 cm dan lebar dan lebar 2,5-5,5 cm , bunganya mekar di malam hari, berwarna kuning atau hijau dengan merah atau ungu urat, berbentuk cangkir, dan muncul langsung dari cabang. Buah berbentuk bola (bulat) dengan diameter 12 cm sampai 30 cm, cangkang keras yang halus, mengkilat atau licin yang menggantung tepat di bawah cabang-cabang. Kulit kayu hijau keras (BTFP, 2005).

Bunganya adalah bunga tunggal atau dalam berkas yang terdiri dari 2-3 bunga, yang muncul pada batang dan cabang, bertangkai, menggantung, panjang lebih kurang 5 cm, berwarna kuning kehijau-hijauan dengan urat berwarna merah. Kelopak bunga mula-mula menutup, kemudian terbelah berbentuk upih atau berbentuk 2-3 taju yang sampai pangkal tidak beraturan, panjang lebih kurang 1 cm. Tabung mahkota bunga membengkok, berbentuk lonceng, berperut dengan lipatan melintang. Benangsari berjumlah 4, dua di antaranya panjang, terdapat

sisa-sisa benang sari yang ke-5. Buahnya berbentuk bola, tertekan sedikit, licin, berwarna hijau mengkilat, kulit buah berkayu, keras, diameter 25 cm. Setiap buah berbiji banyak, bentuk biji pipih, terdapat dalam daging buah yang lumat (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).

6. Kegunaan

Semua bagian dari tanaman majapait dapat dimanfaatkan. Kayunya dapat digunakan untuk kayu bakar, gagang perkakas, tulang rusuk di perahu, bangunan dan belenggu ternak, dan labu untuk cangkir, tas dan alat musik. Buah dan daunnya dilaporkan memiliki khasiat obat (Mahbub, 2011). Daun Crescentia cujete berkhasiat sebagai obat luka baru dan daging buahnya untuk urus-urus. Untuk obat luka baru dipakai sebanyak +10 gram daun Cresentia cujete, dicuci dan diturnbuk sampai halus, ditempelkan pada bagian yang luka dan dibalut dengan kain bersih (Direktorat Bina Perbenihan Tanaman Hutan Sulawesi, 2012).

Penggunaan secara tradisional, daging buah majapait dapat digunakan untuk masalah pernapasan seperti asma dan juga digunakan sebagai pencahar. Kulit kayu digunakan untuk diare berlendir. Rebusan kulit kayu digunakan untuk membersihkan luka dan ditumbuk daun digunakan sebagai tapal untuk sakit kepala. Internal, daun digunakan sebagai diuretik dan juga digunakan untuk mengobati hematoma dan tumor. Buah rebusan digunakan untuk mengobati diare, sakit perut, dingin, bronkitis, batuk, asma, dan uretritis. Daun juga digunakan untuk hipertensi (Julia, 1968).

7. Kandungan Kimia

Mahbub et al. (2011) melaporkan bahwa konstituen utama tanaman majapait terdiri atas tartaric acid, cianhidric, citric acid, crescentic acid, tannins, beta-sitosterol, estigmasterol, alpa and beta amirina, estearic acid, triacontanol,

palmitic acid, flavonoids-quercetin, apigenin, naphthoquinones, iridoids

glycosides, 3-hydroxybutanal glycosides. Senyawa naphtoquinones, iridoid glycosides, aucubin, plumieride,and asperuloside telah dilaporkan sebagai konstituen dari daun tanaman ini (Das et al., 2014).

Dalam penelitian yang dilakukan Das et al.(2014) juga melaporkan bahwa kandungan kimia dari ekstrak etanol daun majapait diidentifikasi berupa

steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Mereka melaporkan bahwa semua fraksi dan ekstrak mentah etanol kulit dan daun memiliki aktifitas antioksidan melalui tes DPPH, FRP dan TAC. Ejelonu et al.

(2011) melaporkan kandungan fitokimia buah majapait terdiri dari phenol, tannins, saponins, alkaloids, flavonoids, anthraquinone, cardenolides,

phiobatannin. Senyawa flavonoid yang ditemukan dapat bertindak sebagai antioksidan dan melindungi sel-sel tubuh dari kerusakan radikal bebas.

B. Metode Penyarian

Ekstraksi adalah penyarian zat-zat berkhasiat atau zat-zat aktif dari bagian tanaman obat, hewan dan beberapa jenis ikan termasuk biota laut (Harbone, 1987). Tujuan ekstraksi bahan alam adalah untuk menarik komponen

kimia yang terdapat pada bahan alam. Ekstraksi ini didasarkan pada prinsip perpindahan massa komponen zat ke dalam pelarut, dimana perpindahan mulai terjadi pada lapisan antar muka kemudian berdifusi masuk ke dalam pelarut (DepKes RI, 1986)

Maserasi merupakan proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan. Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama dan seterusnya. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel maka larutan terdekat didesak keluar (DitJen POM, 2000).

Maserasi dilakukan dengan cara memasukkan 10 bagian simplisia dengan derajat yang cocok ke dalam bejana, kemudian dituangi dengan penyari 75 bagian, ditutup dan dibiarkan selama 5 hari, terlindung dari cahaya sambil diaduk sekali-kali setiap hari lalu diperas dan ampasnya dimaserasi kembali dengan cairan penyari. Penyarian diakhiri setelah pelarut tidak berwarna lagi, lalu dipindahkan ke dalam bejana tertutup, dibiarkan pada tempat yang tidak bercahaya, setelah dua hari lalu endapan dipisahkan (DepKes RI, 1986).

C. Kulit

Kulit adalah suatu organ pembungkus seluruh permukaan luar tubuh, merupakan organ terberat dan terbesar dari tubuh. Seluruh kulit beratnya sekitar

16 % berat tubuh, pada orang dewasa sekitar 2,7 – 3,6 kg dan luasnya sekitar 1,5 – 1,9 meter persegi. Tebalnya kulit bervariasi mulai 0,5 mm sampai 6 mm tergantung dari letak, umur dan jenis kelamin. Kulit tipis terletak pada kelopak mata, penis, labium minus dan kulit bagian medial lengan atas. Kulit tebal terdapat pada telapak tangan, telapak kaki, punggung, bahu dan bokong (Perdanakusuma, 2007).

Kulit merupakan “selimut” yang menutupi permukaan tubuh dan memiliki fungsi utama sebagai pelindung dari berbagai macam gangguan dan ransangan luar (Tranggono, 2007). Kulit menjaga bagian dalam tubuh dari gangguan fisik atau mekanik (tarikan, gesekan,dan tekanan), gangguan kimia (zat-zat kimia yang iritan), gangguan yang bersifat panas (radiasi,sinar ultraviolet) serta gangguan infeksi luar dari bakteri atau jamur. Kulit juga menjalankan fungsi absorbsi, termolegulasi, ekskresi, persepsi, pembentukan pigmen, keratinisasi, dan pembentukan vitamin D (Djuanda, 2007).

Pembagian kulit secara garis besar tersusun atas tiga lapisan utama yaitu lapisan epidermis, lapisan dermis, dan lapisan subkutis (Gambar 2.). _{Tidak ada}

garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, subkutis ditandai dengan adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak Epidermis adalah lapisan luar kulit, terdiri atas stratum korneum, stratum lusidum, stratum granulosum, stratum spinosum, dan stratum basale. Lapisan dermis adalah lapisan dibawah epidermis yang jauh lebih tebal daripada epidermis. Lapisan ini mengandung pembuluh darah, akar rambut, kelenjar keringat, kelenjar minyak serta mengandung sejumlah besar ujung saraf yang berkontribusi terhadap sensasi

nyeri, suhu, gatal, dan tekanan. Subkutis adalah lapisan di bawah dermis. Tidak ada garis tegas yang memisahkan dermis dan subkutis, Subkutis ditandai dengan adanya jaringan ikat longgar dan adanya sel dan jaringan lemak (Perdanakusuma, 2007).

Gambar 2. Struktur anatomi kulit normal (Perdanakusuma, 2007) D. Inflamasi

1. Definisi Inflamasi

Inflamasi adalah respon terhadap cedera jaringan dan infeksi. Ketika proses inflamasi berlangsung, terjadi reaksi vaskular di mana cairan, elemen-elemen darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Proses inflamasi merupakan suatu mekanisme perlindungan di mana tubuh berusaha untuk menetralisir dan membasmi agen-agen yang berbahaya pada tempat cedera dan untuk mempersiapkan keadaaan selama proses perbaikan jaringan (Kee dan Hayes, 1996).

Respon inflamasi sering dikategorikan sesuai dengan durasi, yaitu inflamasi akut atau kronis. Inflamasi akut terjadi sebagai tanggapan langsung

terhadap trauma (cedera atau pembedahan) dengan durasi relatif singkat dari hitungan menit sampai hari. Sedangkan inflamasi kronis mencerminkan respon inflamasi yang berkelanjutan untuk kondisi jangka panjang dari hitungan hari sampai tahun (Anonim, 2015).

Inflamasi akut memiliki durasi relatif singkat, yang berlangsung dari menit sampai dengan hari, dan tergantung dari keparahan cedera yang terjadi. Karakteristik utama dari peradangan akut adalah eksudasi cairan dan plasma protein (edema) dan imigrasi leukosit (terutama neutrofil). Setelah respon inflamasi akut mereda, monosit dan limfosit mendominasi di daerah cedera dan menjadi ciri dari peradangan kronis. Monosit akan bermigrasi dari darah, berdiferensiasi menjadi makrofag dalam jaringan di sisi implan. Makrofag ini akan berfusi atau menyatu menjadi sel raksasa bersama benda asing. Makrofag dan sel raksasa bersama benda asing yang menonjol pada antarmuka jaringan/implan (Black and Hastings, 1998). Adapun karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis terhadap waktu dapat dilihat pada gambar 3.

Gambar 3. Karateristik biomaterial pada inflamasi akut dan kronis (Black and Hastings, 1998)

2. Gejala

Inflamasi menghasilkan gejala-gejala berikut: (1) rasa sakit karena kerja bahan sitotoksik yang dilepaskan dari elemen-elemen humoral, selular, dan microbial pada ujung saraf; (2) pembengkakam disebabkan karena filtrasi makromolekul dan cairan ke dalam jaringan yang terpegaruh; (3 dan 4) kemerah-merahan dan panas, disebabkan karena vasodilatasi pembuluh-pembuluh dan aliran darah ke jaringan yang terpengaruh; dan (5) gangguan fungsi, disebabkan oleh perubahan pada Jaringan yang terpengaruh (Wilmana, 1995).

3. Mekanisme inflamasi

Ketika jaringan terluka, kehadiran infeksi atau kerusakan akan dirasakan oleh sel tubuh, terutama makrofag termasuk juga sel-sel dendritik, sel mast, dan sel lainnya. Sel-sel ini mensekresikan molekul (sitokin dan mediator) yang menginduksi dan mengatur respon inflamasi selanjutnya. Jalur metabolisme arakidonat bertanggung jawab dalam kegiatan enzimatik untuk menghasilkan metabolit yang bertindak sebagai mediator dari banyak sisi penting dari proses inflamasi. Mediator-mediator ini yang menyebabkan vasodilatasi, emigrasi neutrofil, kemotaksis, dan peningkatan permeabilitas pembuluh darah (Mansjoer, 1999).

Asam arakidonat dilepaskan dari fosfolipid di membran sel untuk menanggapi rangsangan, baik mekanik ataupun kimia. Pelepasan asam arakidonat oleh fosfolipase memulai serangkaian reaksi kompleks yang menyebabkan produksi dari keluarga eicosanoid sebagai mediator inflamasi (prostaglandin, leukotrien, dan metabolit terkait). Sintesis eicosanoid mengikuti salah satu dari

dua jalur yaitu: jalur siklooksigenase, yang berpuncak pada sintesis tromboksan A2, prostacylin (PGI2) dan prostaglandin (PGF). Dan jalur lipoksigenase, yang

memuncak pada sintesis leukortrienes (LTs) dan lipoxins (LX) (Williams and

Wilkins, 2011).

Siklooksigenase merupakan asam lemak (COX-1 dan COX-2), yang mengaktifkan arakidonat untuk membentuk prostaglandin endoperoxide (PGG2),

PGG2 secara enzimatis diubah menjadi PGH2 dan dengan bantuan oksigen radikal,

PGH2 selanjutnya membentukan 3 metabolit sebagai berikut:

a) Prostaglandin (PGD2, PGE2 dan PGF2-α). PGD2 dan PGE2 menyebabkan

peningkatan permeabilitas vanular, vasodilatasi dan bronkodilatasi dan menghambat fungsi sel inflamasi. PGF2-α menginduksi vasodilatasi dan

bronkodilatasi

b) Tromboksan A2 (TXA2), dibentuk aktif dalam agregasi plateletyang

menginduksi vasokonstriksi. Trombosit hanya mengepresikan COX-1, sehingga Laufer (2003) menegaskan bahwa TXA2 hanya dapat dibentuk oleh COX-1

c) Prostasiklin (PGI2), PGI2 menginduksi vasodilatasi dan bronkodilatasi dan

menghambat agregasi platelet

(Mohan, 2011).

Enzim lipooksigenase merupakan enzim yang dominan di neutrofil, yang mengaktifkan asam arakidonat untuk membentuk asam eicosatetraenoic

hydroperoxy (5-HPETE) yang diperoksidasi lebih lanjut membentuk 2 metabolit, yaitu:

a) Leukotrien (LT), leukotrien A4 (LT4) merupakan hasil enzimatik dari

5-HPETE untuk membentuk LTB4 (Kemotaktik untuk sel fagosit dan merangsang

sel fagositik adhereence) dan LTC4, LTD4 dan LTE4 yang menyebabkan

vasokonstriksi, bronkokonstriksi dan meningkatkan permeabilitas pembuluh darah

b) Lipoxins (LX), merupakan mediator antiinflamsi hasil derivat dari leukotrien (LT4) yang menghambat kemotaksis neutrofil dan adhesi ke endotelium dan

dengan demikian berfungsi sebagai antagonis endogenenous leukotrien. Trombosit tidak dapat mensintesis LXA4 dan LXB4 tetapi mereka dapat

membentuk mediator ini dari intermediet LTA4 yang berasal dari neutrofil yang

berdekatan, oleh jalur biosintesis transelular

(Mohan, 2011). E. Antiinflamasi

Obat-obat antiinflamasi non-steroid, atau NSAID (Nonsteroidal antiinflammatory drugs) merupakan obat-obat yang menghambat sintesa prostaglandin, mempunyai efek analgesik dan antipiretik yang berbeda-beda tetapi terutama dipakai sebagai agen antiinflamasi untuk meredakan inflamasi dan nyeri (Kee dan Hayes, 1994). Mekanisme utama untuk efek mereka adalah penghambatan ekspresi protein yang disebut siklooksigenase. Protein COX mengkatalisis pembentukan prostanoids (termasuk PG, Prostacyclins, dan tromboksan) dari asam arakidonat. Ketika NSAID menghambat protein COX,

sintesis prostanoids akan berhenti sehinggaakan mengurangi peradangan. NSAID selektivitas akan menghambat salah satu dari dua isoform COX, COX -1 dan COX-2 sedangkan NSAID non-selektif akan menghambat COX-1 dan COX-2 (Porth, 2011). Adapun metabolisme asam arakidonat melalui jalur siklooksigenase dan lipoksigenase dan tempat aksi kerja obat kortikosteroid dan obat-obat antiinflamasi non-steroid dapat dilihat pada gambar 4.

Gambar 4.` Metabolit Asam arakidonat melalui jalur siklooksigen dan jalur lipoxygenase serta target dari obat antiinflamasi (Porth, 2011). Kortikosteroid menghambat aktifitas fosfolipase A2, yang mengurangi

pelepasan asam arakidonat. Dengan demikian, kortikosteroid akan menghambat pembentukan prostaglandin, tromboksan dan leukotrien. Steroid anti-inflamasi menghambat fosfolipase A2 secara tidak langsung dengan pelepasan protein penghambatan, yaitu lipocortin-1. Protein ini merupakan anggota dari superfamili protein yang akan mengikat kalsium dan fosfolipid anionik. Rekombinan

lipocortin-1 ini akan mencegah pelepasan eikosanoid dari paru-paru dan merupakan agen anti-inflamasi yang kuat (Vane, 1996).

F. Sistem Imun

Sistem imun merupakan suatu sistem pertahanan tubuh manusia melalui interaksi yang kompleks pada tingkat molekul, sel, dan jaringan baik lokal dan sistemik. Sistem imun hanya dapat diaktifkan oleh antigen, baik molekul dan ataupun organisme, sehingga menimbulkan respon imun. Sistem imun terdiri atas sistem imun alamiah atau non-spesifik (natural/innate/native) dan didapat atau spesifik (adaptive/acquired) (Bhagavan, 2011).

Sistem imun non-spesifik (sudah ada sejak lahir) merupakan suatu respon cepat yang efektif terhadap serangan patogen dan zat asing. Respon imun yang diperlihatkan selalu respon yang sama. Mekanisme sistem imun non-spesifik bisa melalaui fagositosis yang menyerang partikel asing oleh sel-sel sistem kekebalan tubuh (makrofag dan granulosit) dan inflamasi yang berkerja untuk memulihkan jaringan yang rusak yang ditandai dengan peningkatan aliran darah, peningkatan permeabilitas kapiler, dan melarikan diri dari cairan dan sel-sel dari kapiler membesar ke dalam ruang jaringan (Kent, 2000).

Sistem imun spesifik meliputi sel dan protein dalam darah dan getah bening yang menyerang, menghancurkan, dan mengeluarkan dari tubuh. Respon yang ditimbulkan terbilang lambat dan hanya efektif melawan patogen yang spesifik. Respon yang cepat bila terjadi infeksi berulang dengan patogen yang sama (fenomena yang disebut memori imunologi) (Kent, 2000).

Neutrofil adalah sel fagosit yang menjaga kulit dan selaput lendir. Fungsinya melindungi terhadap antigen yang dirasakan, bermigrasi pada tempat infeksi serta menghancurkan antigennya. Neutrofil beredar dalam darah selama sekitar 6-10 jam tapi bisa tetap dalam jaringan dalam keadaan tidak aktif selama 2-6 hari. Migrasi neutrofil dalam inflamasi akut disertai dengan peningkatan permeabilitas pembuluh darah (Bhagavan, 2011).

G. Flavonoid

Senyawa flavonoid merupakan senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom karbon yang tersusun dalam konfigurasi C6-C3-C6. Kerangka flavonoid

terdiri atas satu cincin aromatik A, satu cincin aromatik B, dan cincin tengah berupa heterosiklik yang mengandung oksigen dan bentuk teroksidasi cincin ini dijadikan dasar pembagian flavonoid ke dalam sub-sub kelompoknya (Redha, 2010). Sistem penomoran digunakan untuk membedakan posisi karbon di sekitar molekul flavonoid dapat dilihat pada gambar 5.

Gambar 5. Konfigurasi C6-C3-C6 flavonoid (Redha, 2010)

Senyawa flavonoid adalah senyawa fenol terbesar yang terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji. Senyawa-senyawa ini merupakan zat warna merah,ungu, dan biru dan sebagian zat kuning yang ditemukan dalam tumbuh-tumbuhan. Flavonoids

dalam tubuh manusia berfungsi sebagai antioksidan dan mempunyai bioktifitas sebagai obat. Manfaat flavonoids antara lain adalaha untuk melindungi stuktur sel, meningkatkan efektifitas vitamin C, antiinflamasi, mencegah keropos tulang dan sebagai antibiotik (Rathee, 2009).

Jaringan dan sel didalam tubuh akan mengalami kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas dari aktifitas RSO (reactive oxygen species) yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Meningkatnya produksi ROS dapat memicu kerusakan pada jaringan sehingga akan memperparah proses inflamasi. Senyawa flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan dengan cara mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah kerusakan jaringan yang semakin parah (Gomes, 2008).

Mekanisme lain flavonoid dalam menghambat terjadinya radang yaitu melalui dua cara, yang pertama menghambat pelepasan asam arakidonat dan sekresi enzim lisosom dari sel neutrofil dan sel endotelial, dan yang kedua menghambat fase proliferasi dan fase eksudasi dari proses radang. Terhambatnya pelepasan asam arakidonat dari sel radang akan menyebabkan kurang tersedianya substrat arakidonat bagi jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin, prostasiklin, endoperoksida, tromboksan di satu sisi dan asam hidroperoksida, asam hidroksieikosatetraienoat, leukotrien di sisi lainnya (Rahayu, 2009).

H. Hematoksilin dan Eosin

Pewarnaan hematoksilin dan eosin merupakan metode pewarnaan yang banyak digunakan dalam pewarnaan jaringan sehingga banyak digunakan dalam

diagnosa medis dan penelitian. Jaringan yang diwarnai dengan hematoksilin dan eosin akan menunjukkan sitoplasma berwarna merah jambu-jingga dan nukleus berwarna gelap, biru atau ungu. Hematoksilin merupakan ekstrak dari pohon

logwood (Haematoxylum campechianum) yang digunakan sebagai bahan pewarna pada pewarnaan histoteknik (Junquera, 2007).

Hematoksilin bekerja sebagai pewarna basa, artinya zat ini mewarnai unsur basofilik jaringan. Produk oksidasi hematoksilin berupa hematin bertindak sebagai bahan aktif dalam larutan pewarnaan. Hematin akan membentuk kompleks berwarna sangat kuat dengan ion logam tertentu, yang paling menonjol adalah garam Fe (III) dan Al (III). Kompleks logam-haematein digunakan untuk mewarnai inti sel sebelum diperiksa di bawah mikroskop. Hematoksilin menandai inti dan struktur asam lainnya dari sel (seperti bagian sitoplasma yang kaya-RNA dan matriks tulang rawan) menjadi biru. Eosin yang bersifat asam akan mewarnai komponen asidofilik jaringan seperti mitokondria, granula sekretoris dan kolagen. Tidak seperti hematoksilin, eosin mewarnai sitoplasma dan kolagen menjadi warna merah muda (IHC World, 2015).

I. Imunohistokimia

Imunohistokimia merupakan metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya protein atau antigen tertentu dalam sel menggunakan antibodi spesifik (IHC, 2015). Imunohistokimia menggabungkan teknik anatomi, imunologi dan biokimia yang memungkinkan untuk memvisualisasikan distribusi dan lokalisasi komponen seluler tertentu dalam sel dan dalam jaringan yang tepat sehingga dapat dilihat di bawah mikroskop (Taylor, 2015).

Tahapan metode imunohistokimia terdiri atas empat tahap yaitu (1) penanaman sel, (2) fiksasi dan perwarnaan dengan antibodi, (3) visualisasi sel dengan mikroskop, dan (4) analisis ekspresi protein yang telah divisualisasikan. Tahapan fiksasi menggunakan pelarut organik seperti alkohol dan aseton untuk melepaskan lipid, mendehifrasi sel,dan mengendapkan protein (The Human Protein Atlas, 2015). Sel yang mengekspresikan protein tertentu akan memberikan warna coklat/gelap, sedangkan sel yang tidak mengekspreiskan protein memberikan warna ungu/biru. Sel yang mengekspresikan protein tertentu dari keseluruhan sel dinyatakan dalam satuan persen (%) (Ikawati, 2006).

J. Karagenin

Iritan yang digunakan untuk pengujian efek antiinflamasi beraga jenisnya, satu diantaranya adalah karagenin. Karagenin merupakan polisakarida hasil ekstraksi rumput laut dari famili Eucheuma, Chondrus, dan Gigartina. Bentuknya berupa serbuk berwarna putih hingga kuning kecoklatan, ada yang berbentuk butiran kasar hingga serbuk halus, tidak 24 berbau, serta memberi rasa berlendir di lidah. Karagenin juga memiliki sifat larut dalam air bersuhu 80ºC (Rowe et all., 2009).

Karagenan terdiri dari tiga tipe, yaitu kappa ( ), lambda (α), dan iota ( ), yang diekstrak dari rumput laut merah. Mereka terutama diambil dari spesies

Gigartina dan Chondrus crispus, yang menghasilkan tipe kappa dan labda dan spesies Eucheuma cottonii dan spinosum, yang menghasilkan kappa dan iota jenis. Setiap jenis karagenan memiliki karakteristik tersendiri, meliputi kekuatan gel, viskositas, stabilitas suhu, sinergisme, dan kelarutannya (Soma et. all, 2013).

Karagenin berperan dalam pembentukan edema dalam model inflamasi akut. Karagenin dipilih karena dapat menstimulasi pelepasan prostaglandin setelah disuntikkan ke hewan uji. Oleh karena itu, karagenin dapat digunakan sebagai iritan dalam metode uji yang bertujuan untuk mencari obat-obat antiinflamasi, tepatnya yang bekerja dengan menghambat sintesis prostaglandin (Winter et all., 1962).

K. Hidrokortison

Hidrokortison merupankan anti inflamasi steroid yang secara dramatis menurunkan manifetasi dari inflamasi. Hidrokortison menghambat manifestasi awan dan akhir inflamasi,yaitu tidak hanya tanda-tanda radang (kemerahan, panas, sakit, edema, dan gangguan fungsi), tetapi juga stadium lebih lanjut penyembuhan luka dan perbaikan dan reaksi proliferasi yang terlihat pada inflamasi kronis. Hidrokortison mempengaruhi semua tipe reaksi inflamasi yang disebabkan baik oleh invasi patogen, rangsangan kimia atau fisik, ataupun oleh respon immun yang tidak tepat seperti terlihat pada hipersensitivitas atau penyakit autoimmun (Tjay, 2007).

L. Landasan Teori

Inflamasi merupakan respons protektif setempat yang ditimbulkan oleh cedera atau kerusakan jaringan. Respon yang muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri), dan tumor (pembengkakan). Penyebab inflamasi antara lain mikroorganisme, trauma mekanis, zat-zat kimia, dan pengaruh fisika. Selama proses inflamasi terjadi reaksi vaskular di mana cairan, elemen-elemen

darah, sel darah putih (leukosit), dan mediator kimia berkumpul pada tempat cedera jaringan atau infeksi. Metabolisme asam arakidonat bertangung jawab sebagai substrat utama dalam produksi mediator-mediator inflamasi. Prostaglandin dan tromboksan dihasilkan melalui jalur siklooksgenase. Leukotriene, lipoksin, dan komponen penginduksi inflamasi lainnya dihasilkan melalui jalur lipooksigenase.

Aktivitas protein siklooksigenase (COX) bertanggung jawab untuk pengeluaran produksi prostaglandin (PG) yang tinggi selama proses inflamasi dan respon imum melalui metabolisme asam arakidonat. Respon imun berupa migrasi sel neotrofil ke daerah inflamasi merupakan fase seluler awal proses inflamasi. Penurunan jumlah sel neutrofil yang secara langsung menghambat pelepasan asam arakidonat yang menyebabkan kurang tersedianya substart arakidonat bagi jalur siklooksigenase, yang pada akhirnya akan menekan jumlah prostaglandin.

Tanaman majapait merupakan salah satu tanaman yang memiliki efek terapetik dengan kandungan kimia didalamnya teriidentifikasi berupa steroids, flavonoids, saponins, tannins, glycosides dan terpenoids. Pendekatan penelitian ini didasarkan pada penelitian yang dilakukan Das et al. (2014) yang melaporkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 100 g/ml menunjukan aktifitas antioksidan melalui pengujian dengan DPPH, FRP dan TAC tests. Penelitian yang dilakukan Parvin et al.(2015) juga melaporkan bahwa hasil uji in-vitro menggunakan metode HRBC (Human Red Blood Cell) dengan membrane stabilization menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun majapait pada konsentrasi 1 mg/ml memiliki aktifitas anti-inflamasi. Adanya aktifitas antiinflamasi dari

pemberian ekstrak daun majapait secara in-vitro, diduga juga akan memperlihatkan adanya efek antiinflamasi apabila diberikan secara topikal.

Kandungan flavonoid pada daun majapait diduga bertanggung jawab dalam memberi efek antiinflamasi. Flavonoid dapat berperan sebagai antioksidan dengan cara mengikat berbagai macam radikal bebas sehingga mencegah kerusakan jaringan yang semakin parah akibat aktifitas radikal bebas dari RSO yang dihasilkan dari proses metabolisme oksigen sel radang. Flavonoid juga menghambat pelepasan asam arakidonat dari sel radang sehingga menyebabkan berkurangnya ketersedian substrat arakidonat, baik jalur siklooksigenase dan jalur lipooksigenase, untuk membentuk mediator inflamasi.

Sel neutrofil dan protein COX-2 dalam proses inflamasi, keduanya merupakan target molekuler dalam skrining senyawa dari bahan alam yang berperan sebagai agen antiinflamasi. Pengujian terhadap efek antiinflamasi ekstrak etanol daun majapait dilakukan melalui pengamatan histopatologis jaringan kulit punggung mencit yang diinduksi karagenin 3%. Migrasi sel neutrofil dapat dideteksi dengan menggunakan metode pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) untuk melihat penghambatan migrasi sel neutrofil. Pengukuran ekspresi protein COX-2 dapat dilakukan dengan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 untuk melihat penekanan ekspresi COX-2.

M. Hipotesis

Ekstrak etanol daun Crescentia cujete L. memberikan efek antiinflamasi topikal dengan berkurangnya migrasi sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2 pada kulit punggung mencit diinduksi karagenin 3%.

30 BAB III

METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian tentang efek antiinflamasi topikal ekstrak etanol daun Crescentia cujete pada mencit betina galur Swiss diinduksi karagenan merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan menggunakan rancangan acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definifi Operasional 1. Variabel Penelitian

a. Variabel utama

1) Variabel bebas : Konsentrasi ekstrak etanol daun majapait. 2) Variabel tergantung :

a) Jumlah sel-sel neutrofil yang bermigrasi

b) Penekanan ekspresi siklooksigenase-2 didaerah subkutan. b. Variabel pengacau

1) Variabel pengacau terkendali

a) Subyek uji : Mencit betina galur Swiss b) Umur : 6 – 8 minggu (2-3 bulan) c) Berat badan : 20-30 gram

d) Keadaan subyek : Sehat

2) Variabel pengacau tidak terkendali : kondisi patofisiologis mencit yang digunakan dalam penelitian.

2. Definisis oprasional

a. Inflamasi merupakan mekanisme pertahanan tubuh sebagai respon normal terhadap trauma fisik, zat kimia berbahaya atau agen mikrobiologi. Adapun respon yang umumnya muncul meliputi rubor (kemerahan), kalor (panas), dolor (nyeri) dan tumor (pembengkakan). b. Migrasi Neutrofil merupakan sel leukosit yang bermigrasi dari pembuluh

darah ke daerah subkutan (punggung mencit) dalam 3 bentuk berbeda yaitu, berinti satu, berinti dua dan beriti ladam kuda pada pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3%.

c. Ekspresi COX-2 merupakan ekspresi COX-2 oleh sel neutrofil yang berwarna coklat/gelap pada daerah subkutan jaringan kulit mencit selama pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3%.

d. Daun Crescentia cujete yang digunakan merupakan daun yang berwarna hijau segar, tidak berlubang, serta tidak terdapat kotoran dari binatang kecil yang didapat dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta.

e. Ekstrak etanol daun Crescentia cujete merupakan hasil ekstraksi simplisia daun Crescentia cujete seberat 15 gram yang dimaserasi pada 100 mL etanol 70% selama dua hari. Kemudian diremaserasi dalam jumlah pelarut yang sama selama satu hari, disaring dengan kertas saring, dan dipekatkan pada waterbath hingga menjadi ekstrak kental.

f. Konsentrasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete merupakan berat ekstrak kental etanol daun Crescentia cujete (gram) dalam basis (gram)

dengan satuan b/b. Konsentrasi ekstrak kental daun Crescentia cujete

yang digunakan adalah 1,67; 2,5; dan 3,75 %.

g. Efek antiinflamasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete adalah kemampuan ekstrak etanol daun Crescentia cujete untuk mengurangi migrasi sel-sel neutrofil dan penekanan ekspresi COX-2 pada daerah subkutan secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah injeksi karagenin 3 %.

h. Injeksi subkutan merupakan injeksi yang dilakukan pada jaringan di bawah kulit pada punggung mencit yang sudah dicukur rambutnya terlebih dahulu.

i. Pemberian topikal ekstrak daun Crescentia cujete dilakukan dengan cara mengoleskan sediaan sebanyak 0,1 gram yang menutupi area seluas 2,25 cm2 (1,5 cm x 1,5 cm) pada kulit punggung kulit mencit yang telah diinduksi karagenin 3% secara subkutan.

C. Bahan penelitian

Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu :

1. Hewan uji pada penelitian ini mengunakan mencit betina galur Swiss yang berumur sekitar 6 – 8 minggu (2-3 bulan) dengan bobot sekitar 20- 30 gram dalam kondisi yang sehat yang diperoleh dari Laboratorium Imuno Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Prosedur penelitian ini telah memperoleh kelayakan etik dari Ministry of Nasional Education Faculty of

Medicine dan Medical and Health Research Ethics Committee (MHREC)

dengan nomor KE/61/05/2015.

2. Bahan uji daun majapait diperoleh dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta.

3. Karagenin tipe I (Sigma Chemical co.) sebagai inflamatogen diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Falkutas Farmasi Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

4. Etanol 70% diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70, Ngampilan, Yogyakarta

5. NaCl 0,9% teknis sebagai pelarut karagenin diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta.

6. Akuades diperoleh dari PT. Brataco di Jl. Letjend Suprapto No. 70, Ngampilan, Yogyakarta.

7. Biocream® diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta, Depok, Sleman, Yogyakarta.

8. Hidrokortison cream sebagai control positif mengandung Hidrokortison Asetat 2.5% diproduksi oleh Galenium, diperoleh dari dari Apotek K-24 Yogyakarta, Depok, Sleman, Yogyakarta.

9. Veet® sebagai perontok bulu diproduksi oleh Reckitt Benckiser, diperoleh dari Alfamart Paingan Sleman.

D. Alat atau Instrument Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari

1. Alat Ekstraksi a) Oven

b) Mesin Penyerbuk c) Ayakan no. 40

d) Alat-alat Gelas ( Labu ukur, gelas beker, erlemeyer, gelas ukur, cawan porselen, pipet tetes, batang pengaduk dan gelas arloji)

2. Alat induksi dan pengukuran edema kulit punggung mencit dan lain-lain a) Neraca analitik

b) Gunting c) Gelas arloji d) Stopwatch

e) Spuit injeksi 1 mL f) Stopwatch

g) Mikroskop cahaya Olympus CX21 h) Jangka sorong digital

i) Mortir dan Stamper

3. Alat dan bahan yang digunakan pemotongan organ kulit a) Formalin 10%

b) Karton

c) Gunting bedah d) Container

e) Pinset

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman Crescentia cujete dengan cara mencocokkan ciri-ciri makroskopik yang terdapat pada tanaman yang dilakukan secara benar menurut Steenis (1992) di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan Bahan

Pengumpulan sampel dilakukan secara purposif, yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Daun Crescentia cujete didapat dari warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta dan dipanen serta dikumpulkan. Daun yang digunakan adalah daun yang berwarna hijau, segar, tidak berlubang dan tidak terdapat kotoran binatang.

3. Pembuatan Simplisia

Pembuatan simplisia daun Crescentia cujete diawali dengan mencuci bersih daun majapait yang telah dipanen menggunakan air mengalir dan ditiriskan untuk meniadakan airnya. Kemudian dikeringkan kembali menggunakan oven pada suhu 30-45 derajat celcius hingga benar-benar kering ditandai dengan warna daun hijau kecoklatan dan mudah dihancurkan. Selanjutnya daun diserbuk dengan mesin penyerbuk. Serbuk yang diperoleh diayak menggunakan ayakan nomor 40.

4. Pembuatan Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete

Ekstraksi etanol daun Crescentia cujete dilakukan dengan mengambil 15 gram serbuk kering daun Crescentia cujete direndam dengan 100 mL etanol

70% pada erlemeyer bersumbat. Ekstraksi dilakukan secara maserasi selama 2 hari terlindungi dari cahaya pada temperatur kamar di atas shaker mekanik. Setelah 2 hari, hasil maserasi disaring untuk memisahkan filtrat dan endapannya. Kemudian ampasnya diremaserasi dengan melarutkanya kembali dalam jumlah dan volume pelarut yang sama selama 1 hari. Kemudian disaring untuk mendapatkan filtrat. Hasil filtrat maserasi dan remaserasi disatukan. Selanjutnya pelarut ekstrak diuapkan menggunakan waterbath

hingga diperoleh ekstrak kental dengan bobot yang tetap. 5. Pembuatan Krim Ekstrak Daun Crescentia cujete

Konsentrasi krim ekstrak etanol daum majapait ditentukan bedasarkan konsentrasi zat aktif hidrokortison asetat 2,5 % sebagai kontrol positif. Konsentrasi tersebut dijadikan konsentrasi tengah (konsentrasi ke-2) untuk sediaan krim ekstrak etanol daun Crescentia cujete. Konsentrasi pertama diturunkan 1,5 kalinya dan konsentrasi ke-3 dinaikan 1,5 kalinya. Maka didapat tiga konsentrasi ekstrak etanol daun Crescentia cujete dalam krim yaitu 1,67; 2,5; dan 3,75 % b/b. Pembuatan krim ekstrak etanol daun

Crescentia cujete dengan menimbang ekstrak etanol daun Crescentia cujete

seberat 0,167; 0,25; dan 0,375 g yang dilarutkan dalam 10 g basis Biocream®.

6. Penyiapan Hewan Uji

Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 33 ekor mencit betina galur Swiss, berumur 2-3 bulan, dengan bobot 20-30 gram. Hewan uji dibagi secara acak menjadi 2 kelompok. Kelompok untuk pra-pelakuan sebanyak 3 ekor mencit

dan kelompok perlakuan sebanyak 30 ekor mencit. Kelompok perlakuan terdiri dari enam kelompok yang masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor mencit.

Hewan uji terlebih dahulu dicukur bulu punggungnya dengan gunting, kemudian dioleskan Veet® untuk merontokkan bulu yang belum tercukur sempurna. Kulit punggung yang telah dicukur bulunya dibiarkan selama 1 hari untuk menghindari adanya inflamasi yang disebabkan oleh pencukuran dan pemberian Veet®.

7. Uji Pendahuluan

Uji pendahuluan bertujuan untuk menetapkan konsentrasi karagenin optimal yang akan digunakan sebelum peneliti melakukan uji efek antiinflamasi topikal. Konsentrasi karagenin 1,5; 2 dan 3% dibuat dengan menimbang masing-masing karagenin sebanyak 1,5; 2; dan 3g karagenin dan melarutkanya dengan larutan fisiologis NaCl 0,9% dalam gelas beker yang kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan larutan NaCl 0,9% hingga batas tanda.

Tiga ekor mencit yang digunakan dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan konsentrasi karagenin, yaitu karagenin 1,5; 2; dan 3% masing-masing kelompok diinjeksi sebanyak 0,1 mL secara subkutan pada kulit punggung mencit yang telah dicukur bulunya. Tebal lipat kulit diukur setelah pemberian karagenin setiap 1 jam selama 6 jam. Kelompok karagenin yang dipilih, apabila edema yang timbul menunjukkan penebalan lipatan kulit sebesar 2-3 kali dari tebal lipat kulit awal .

8. Pembuatan larutan Karagenin

Karagenin 3% dibuat dengan melarutkan 3 g karagenin dalam larutan NaCl 0,9% hingga 100 mL sehingga diperoleh larutan Karagenin 3% b/v. 9. Pengujian Ekstrak Etanol daun Crescentia cujete

Sebanyak 30 ekor mencit betina dibagi secara acak menjadi enam kelompok perlakuan :

a. Kelompok 1

Terdiri dari lima ekor mencit sebagai kontrol negatif (karagenin). Mencit diinjeksi karagenin dengan konsentrasi 3% secara subkutan. b. Kelompok 2,3,4, 5, dan 6

Masing-masing terdiri dari lima ekor mencit sebagai perlakuan Biocream®, Hidrokortison, dan ekstrak etanol daun Crescentia cujete

1,67%; 2,5%; dan 3,75% b/b. Ekstrak Seberat 1,67; 2,5; dan 3,75 gram masing-masing dicampur dengan basis krim (Biocream®) seberat 10 gram sehingga didapat konsentrasi 1,67; 2,5%; 3,75% b/b. Mencit terlebih dahulu diinjeksi karagenin dengan kosentrasi 3% secara subkutan. Selanjutnya Biocream®, Hidrokortison, dan masing-masing konsentrasi ekstrak dalam basis krim diambil sebanyak 0,1 gram untuk dioleskan seluas 2,25 cm2 disekitar suntikan segera setelah injeksi karagenin 3%.

10. Pengambilan bagian kulit punggung mencit untuk data histopatologi Dua puluh empat jam setelah diinjeksi karagenin 3% mencit dikorbankan dengan cara dislokasi tulang leher mencit dan dilakukan pengambilan kulit

punggung mencit dengan cara dibedah yang dilakukan dipapan bedah. Area pengambilan kulit disekitar daerah injeksi subkutan dengan ukuran 1 x 1cm. Hasil pemotongan jaringan kulit diletakkan di container yang telah berisi larutan fiksatif yaitu formalin 10% hingga potongan kulit terendam sempurna yang kemudian dibawa ke bagian Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada untuk pembuatan preparat histologi. Pengecatan hematoksilin dan eosin (HE) dikerjakan di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada dan imunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2 dilakukan di Laboratorium Patologi Anatomi RS Dr. Sardjito, Yogyakarta. Hasil pengecatan dianalisis di bawah mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan perbesaran 400x di Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Gajah Mada.

F. Teknik Analisis Data

1. Analisis hasil dilakukan dengan menghitung jumlah sel neutrofil yang bermigrasi dan sel yang mengekspresikan COX-2 pada daerah subkutan jaringan kulit punggung mencit pada 5 sudut pandang yang berbeda di bawah mikroskop cahaya (Olympus CX21) dengan perbesaran 400x.

2. Nilai persentase ekspresi COX-2 masing-masing perlakuan dihitung dengan persamaan:

3. Menghitung persentase penekanan ekspresi COX-2

(Ikawati, 2006)

4. Data yang diperoleh terlebih dahulu dianalisis secara statistik dengan

Shapiro-Wilk untuk melihat kenormalan dan homogenitas distribusi data. Data yang terdistribusi dengan normal dan homogenitas sama dilanjutkan dengan uji One Way ANOVA (taraf kepercayaan 95%) karena skala variabel penelitian adalah skala numerik, data tidak berpasangan dan lebih dari dua kelompok. Analisis dilanjutkan dengan Post Hoc Test dengan Scheffe tes.

Namun jika syarat uji One Way ANOVA tidak dapat dipenuhi maka digunakan uji alternatif non-parametrik Kruskal Wallis. Apabila uji Kruskal Wallis menunjukkan perbedaan signifikan (p<0,05) maka dilanjutkan dengan

41 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Determinasi Tanaman

Tanaman majapait yang digunakan pada penelitian efek antiinflamasi topikal diperoleh dari tanaman milik warga di Jl. Garuda, No. 168, Pringwulung, Yogyakarta. Tanaman majapait selanjutnya dideterminasi di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan tujuan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan peneliti.

Bagian tanaman majapait yang digunakan peneliti untuk determinasi yaitu batang, daun, bunga dan buah. Hasil determinasi berdasarkan buku acuan menurut Steenis (1992) menunjukan bahwa tanaman yang digunakan dalam penelitian ini adalah benar tanaman Crescentia cujete L. yang dikenal dengan nama tanaman majapait atau berenuk (Lampiran 1).

B. Ekstrak Etanol Daun Crescentia cujete

Ekstrak etanol daun Crescentia cujete diperoleh dari penyarian serbuk simplisia daun Crescentia cujete secara maserasi. Daun majapait yang telah kering sempurna diserbuk mengunakan mesin penyerbuk. Penyerbukan bertujuan untuk memperluas permukaan serbuk yang kontak dengan pelarut sehingga mempermudah penyarian kandungan fitokimia dari daun majapait.

Serbuk daun majapait ditimbang seberat 15 gram dan ditambahkan 100 mL etanol 70% pada Erlenmeyer bersumbat selama dua hari di atas shaker

terkandung dalam serbuk agar larut dalam cairan penyarinya. Prinsipnya, cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut, karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan di luar sel maka larutan terdekat didesak keluar (DitJen POM, 2000). Untuk mempercepat kesetimbangan larutan di dalam dan di luar sel, dilakukan pengadukan yang kostan dengan bantuan mechanical shaker sehingga proses ekstraksi hanya memakan waktu dua hari kerja. Selanjutnya dilakukan proses remaserasi untuk mengoptimalkan penarikan senyawa kimia yang terkandung dalam serbuk daun majapait dengan menggunakan pelarut baru karena pelarut pertama sudah jenuh sehingga tidak dapat melarutkan semua senyawa kimia tersebut.

Hasil filtrat maserasi dan remaserasi disatukan dan selanjutnya diuapkan di atas waterbath menggunakan cawan porselin pada suhu 50-600C hingga bobotnya tetap sehingga didapatkan ekstrak kental. Hasil ekstrak kental yang didapatkan yaitu seberat 2,2 gram ekstrak kental, sudah tidak dapat dituang lagi, dan tidak berbau etanol. Ekstrak kental yang diperoleh dengan rendemen sebesar 14,67% digunakan untuk pengujian antiinflamasi dalam penelitian ini.

Pemilihan metode penyarian secara maserasi karena mempunyai keuntungan dari metode penyarian lainnya. Prosedur dan peralatan yang digunakan pada metode penyarian ini sederhana dan murah, pelarut yang digunakan juga terbatas (Walton, 1999). Metode maserasi juga dapat menurunkan resiko terurainya bahan alam karena pemanasan, mengingat kandungan bahan alam dari daun majapait tidak diketahui secara pasti tahan panas atau tidak.

g.

Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi

1,67%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Kontrol Biocream 5 3.00 15.00

Ekstrak daun majapait 1,67% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

b. Grouping Variable: Perlakuan

h.

Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi

2,5%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Kontrol Biocream 5 3.00 15.00

Ekstrak daun majapait 2,5% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

i.

Kontrol Biocream® vs ekstrak etanol daun majapait konsentrasi

3,75%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Kontrol Biocream 5 3.00 15.00

Ekstrak daun majapait 3,75% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

b. Grouping Variable: Perlakuan

j.

Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Kontrol Positif 5 8.00 40.00

Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

k.

Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Kontrol Positif 5 8.00 40.00

Ekstrak daun majapait 2,5% 5 3.00 15.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

b. Grouping Variable: Perlakuan

l.

Kontrol positif vs Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 3,75%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Kontrol Positif 5 8.00 40.00

Ekstrak daun majapait 3,75% 5 3.00 15.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

m.

Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% vs 2,5%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Ekstrak daun majapait 2,5% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

b. Grouping Variable: Perlakuan

n.

Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 1,67% vs 3,75%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Ekstrak daun majapait 1,67% 5 3.00 15.00 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 8.00 40.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U .000

Wilcoxon W 15.000

Z -2.611

Asymp. Sig. (2-tailed) .009 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .008a a. Not corrected for ties.

o.

Ekstrak etanol daun majapait konsentrasi 2,5% vs 3,75%

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

Persen Penekanan Enzim COX-2

Ekstrak daun majapait 2,5% 5 5.20 26.00 Ekstrak daun majapait 3,75% 5 5.80 29.00

Total 10

Test Statisticsb

Persen Penekanan Enzim COX-2

Mann-Whitney U 11.000

Wilcoxon W 26.000

Z -.313

Asymp. Sig. (2-tailed) .754

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .841a a. Not corrected for ties.

Biografi Penulis

Penulis skripsi dengan

judul “Uji Efek Antiinflamasi

Topikal Ekstrak Etanol Daun Majapait (

Crescentia

cujete

L.)

terhadap Jumlah Neotrifil dan Ekspresi

Siklooksigenase 2 pada Mencit Terinduksi Karagenin”

memiliki nama lengkap Dui Sostales, merupakan anak

bungsu dari dua bersaudara pasangan Sopian dan

Illuminata. Penulis dilahirkan di Sidas pada tanggal 26

Agustus 1993, Kalimantan Barat. Pendidikan formal

yang

telah

ditempuh

yaitu

mengawali

masa

pendididkannya di SDN 2 Sidas (1999-2005),

kemudian melanjutkan pendidikan di SMP Kristen

Makedonia Plasma II (2005-2008). Pendidikan

Sekolah Menegah Atas ditempuh di SMA Kristen

Makedonia (2008-2011). Penulis kemudian melanjutkan pendidikan serjana di

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta pada tahun 2011 di Falkutas Pendidikan

Fisika. Tahun 2012, penulis memutuskan untuk pindah ke Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

Semasa kuliah penulis cukup aktif dalam kegiatan di fakultas, khususnya pada

UKF Basket dan Voli, penulis menjadi anggota aktif (2012-2015). Penulis pernah

menjadi asisten pratikum Farmakologi Toksikologi tahun ajaran 2014/2015, serta

menjadi peserta di beberapa seminar.