25
BAB III METODOLOGI PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang efek antiinflamasi ekstrak Milk Thistlesecara topikal pada mencit betina galur Swiss adalahjenis penelitian eksperimental murni dengan
menggunakan rancangan acak lengkap pola searah.
B. Variabel penelitian dan Definisi Operasional
1. Variabel penelitian
a. Variabel utama
1 Variabel bebas : konsentrasi dari ekstrak Milk Thistle
2 Variabel tergantung : pengurangan sel-sel neutrofl dan ekspresi pada
COX-2 pada daerah subkutan yang diinduksi karagenin dan diberikan denganekstrak Milk Thistle
b. Variabel pengacau
1 Variabel pengacau terkendali
a Subyek uji
: mencit betina galur Swiss b
Umur subyek uji : 2-3 bulan 6
–8 minggu c
Berat badan subyek uji : 20
–30 gram d
Keadaan subyek uji : sehat
2 Variabel pengacau takterkendali : kondisi patofisiologis mencit
yang digunakan dalam penelitian ini. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
2. Skala Variabel
1. Ekstrak Milk Thistle: skala nominal
2. Penghitungan jumlah sel radang dan ekspresi COX-2 dari efek antiinflamasi :
skala numerik
3. Definisi Operasional
a. Ekstrak Milk Thistledidapatkan dari Naturex ltimate Botanical Benefit, Eropa.
Dibuktikan dengan adanya sertifikat dari Naturex. Dalam sertifikat tersebut di cantumkan bahwa ekstrak ini berbentuk serbuk dengan warna kuning kecoklatan.
Ekstrak ini merupakan ekstrak etanol air dengan total etanol residual 0,1 yang berarti bahwa ekstrak ini aman bagi tubuh.
b. Perhitungan jumlah neutrofil yang bermigrasi dari pembuluh darah ke daerah
subkutan punggung mencit dan ekspresi COX-2 secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah diinjeksikan karagenin 3 . Pengukuran ini dilakukan
karena sel neutrofil adalah sel yang bermigrasi pertama dan mendominasi pada 6 sampai 24 jam pertama yang dilakukan pengecatan Hematoksilin dan Eosin
HE, serta ekspresi COX-2 yang diduga merupakan sel neutrofil setelah dilakukan pengecatan dengan menggunakan antibodi anti COX-2.
c. Pengecatan Hematoksilin dan Eosin HE ini bertujuan untuk memberikan
gambaran kemampuan ekstrak Milk Thistledalam memberikan efek antiinflamasi yang dinyatakan dengan penurunan jumlah migrasi sel neutrofil pada daerah
subkutan. Perhitungan migrasi sel neutrofil mengunakan perhitungan langsung direct counting dengan mikroskopbinokuler Olympus® untuk setiap lima
bidang pandangberbeda denganperbesaran 400 kali. Metode ini dimulai dengan membedah kulit punggung mencit setelah diinjeksi dengan karagenin 3 serta
pemberian perlakuan pada pengamatan selama 24 jam. Bagian kulit yang diambil diawetkanmengunakan larutan fiksatif, yaitu larutan formalin 10. Pengawetan
bertujuan untuk mengawetkan morfologi sel dan jaringan sesuai dengan kondisi pada saat hewan uji masih dalam keadaan hidup
d. Pengujian dengan metode immunohistokimia dengan antibodi anti-COX-2
bertujuan untuk mengetahui mekanisme antinflamasi dari ekstrak etanol daun maja melalui pemeriksaan ekspresi protein COX-2. Pemeriksaan ekspresi COX-2
ekstrak Milk Thistledilakukan dengan melakukan pengecatan mengunakan antibodi anti COX-2 terhadap sel kulit punggung kulit yang selanjutnya
dianalisis secara kuantitatif. e.
Efek antiinflamsi ekstrak Milk Thistlemerupakan kemampuan ekstrak Milk Thistleuntuk mengurangi akumulasi jumlah sel neutrofil dan ekspresi COX-2 di
daerah subkutan secara mikroskopik pada pengukuran 24 jam setelah dilakukan penginjeksian karagenin 3.
f. Pemberian secara topikal ekstrak Milk Thistledilakukan dengan cara
mengoleskan sediaan sebanyak 0,1 gram yang akan menutupi area seluas 2,25 cm
2
1,5 cm x 1,5 cm pada punggung kulit mencit setelah pemberian dengan karagenin secara merata.
g. Injeksi subkutan merupakan jenis injeksi yang dilakukan pada jaringan di bawah
kulit pada punggung kulit yang sudah dicukur rambutnya terlebih dahulu. PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
C. Bahan Penelitian
Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : 1.
Bahan uji yaitu ekstrak ekstrak Milk Thistleyang diperoleh dariNaturexltimate Botanical Benefit, Eropa
2. Hewan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah mencit betina galur Swiss
yang berumur sekitar 6 – 8 minggu 2-3 bulan dengan bobot sekitar 20- 30
gram dalam kondisi yang sehat yang diperoleh dari Laboratorium Immunologi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
3. Karagenin yang digunakan dalam penelitian ini adalah karagenin tipe I Sigma
Chemical co. sebagai Inflamatogen yang diperoleh dari Laboratorium Farmakologi dan Toksikologi Falkutas Farmasi Universitas Islam Indonesia.
4. Etanol diperoleh dari PT. Brataco.
5. NaCl 0,9 sebagai pelarut karagenin diperoleh dari Apotek K-24 Yogyakarta.
6. Akuades diperoleh dari PT. Brataco.
7. Biocream® sebagai basis krim diproduksi oleh Meck.
8. Hidrokortison cream sebagai control positif mengandung Hidrokortison Asetat
2.5 diproduksi oleh Galenium. 9.
Veet® sebagai perontok bulu diproduksi oleh Reckitt Benckiser.
D. Alat Penelitian dan Instrumen Penelitian
Alat – alat yang digunakan dalam penelitian antara lain :
1. Alat Ekstraksi :
a. Oven
b. Etanol
c. Mesin penyerbuk
d. Ayakan no. 40
e. Alat
– alat gelas Labu ukur, gelas beer, erlenmeyer, gelas ukur, cawan porselin, pipet tetes,
batang pengaduk dan gelas arloji. 2.
Alat induksi dan pengukuran edema kulit punggung mencit dan lain-lain a.
Gunting b.
Alat pencukurur bulu mencit c.
Spuit injeksi 1 ml d.
Mortir dan stamper e.
Neraca analitik f.
Stopwatch g.
Jangka sorong digital h.
Mikroskop binokuler 3.
Alat dan bahan yang digunakan untuk pemotongan organ kulit a.
Karton PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
b. Container
c. Papan lilin dan pines
d. Gunting bedah
e. Pinset
f. Formalin 10
E. Tata cara Penelitian
Kategori