Jenis dan Rancangan Penelitian Alat Penelitian Tata Cara Analisis Hasil

26

BAB III METODE PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

Variabel-variabel yang digunakan adalah sebagai berikut :

1. Variabel Utama

a. Variabel bebas Lama pemberian infusa daun M. tanarius, yaitu variasi waktu pemberian infusa daun M. tanarius dengan dosis tertentu pada tikus jantan terinduksi karbon tetraklorida b. Variabel tergantung Kadar ALT dan AST pada tikus jantan galur Wistar yang terinduksi karbon tetraklorida setelah pemberian infusa daun M. tanarius secara akut.

2. Variabel Pengacau

a. Variabel pengacau terkendali. Variabel pengacau terkendali dalam penelitian ini adalah kondisi hewan uji, yaitu tikus galur Wistar dengan jenis kelamin jantan, berat badan 150-250 g, dan umur 2-3 bulan, frekuensi pemberian infusa daun M. tanarius, yaitu secara berturut-turut selama ½, 1, 2, 4, dan 6 jam, cara pemberian hepatotoksin secara intraperitonial, cara pemberian infusa secara per oral, bahan uji yang digunakan berupa daun M. tanarius, yang diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Sanata Dharma b. Variabel pengacau tak terkendali. Variabel pengacau tak terkendali dalam penelitian ini adalah keadaan patologis dan fisiologis hewan uji

3. Definisi Operasional

a. Daun M. tanarius Daun yang diambil dari tanaman M. tanarius adalah yang berwarna hijau, segar, tidak bercacat, dan dipanen pada saat tanaman sedang berbunga. b. Infusa daun M. tanarius Infusa didapatkan dengan cara menginfundasi 100,0 g serbuk kering daun M. tanarius dalam 300,0 ml air pada suhu 90 C selama 15 menit sehingga diperoleh konsentrasi infusa daun M. tanarius 100. c. Pengaruh waktu protektif pemberian infusa M. tanarius Merupakan kemampuan infusa daun M. tanarius dosis tertentu yang diberikan dalam waktu tertentu secara akut yang melindungi hati dengan cara menurunkan kadar ALT-AST pada tikus Wistar terinduksi karbon tetraklorida . d. Akut Penelitian dilakukan secara berturut-turut dengan selang waktu ½, 1, 2, 4, dan 6 jam.

C. Bahan Penelitian 1. Bahan utama

a. Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini yaitu tikus jantan galur Wistar dengan umur 2-3 bulan dan berat badan 150-250 g yang diperoleh dari Laboratorium Imono Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Bahan uji yang digunakan adalah daun M. tanarius yang diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bahan kimia

a. Bahan hepatotoksin yang digunakan adalah karbon tetraklorida yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. b. Kontrol negatif berupa olive oil Bertolli c. Pelarut untuk infusa dengan aquadest yang diperoleh dari Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. d. Blanko pengujian ALT dan AST menggunakan aqua bidestilata yang diperoleh dari Laboratorium Kimia Analisis dan Instrumental Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. e. Kontrol serum Cobas PreciKontrol ClimChem Multi 1 Roche Hitachi Analyzer. f. Reagen ALT Reagen serum yang digunakan adalah reagen ALT dyasis. Komposisi dan konsentrasi dari reagen ALT adalah sebagai berikut. Komposisi pH Konsentrasi R1 : TRIS 7,15 140 mmolL L-Alanine 700 mmolL LDH lactate dehydrogenase ≥ 2300 UL R2 : 2-Oxoglutarate 85 mmolL NADH 1 mmolL Pyridoxal-5 phosphate FS : Good’s buffer pH 9,6 100 mmolL Pyridoxal-5-phosphate 13 mmolL g. Reagen AST Reagen serum yang digunakan adalah reagen ALT dyasis. Komposisi dan konsentrasi dari reagen AST adalah sebagai berikut. Komposisi pH Konsentrasi R1 : TRIS 7,65 110 mmolL L – Aspartate 320 mmolL MDH malate dehydrogenase ≥ 800 UL LDH lactate dehydrogenase ≥ 1200 UL R2 : 2-Oxoglutarate 65 mmolL NADH 1 mmolL Pyridoxal-5 phosphate FS : Good’s buffer pH 9,6 100 mmolL Pyridoxal-5-phosphate 13 mmolL

D. Alat Penelitian

1. Alat pembuatan serbuk kering daun M. tanarius Oven, mesin penyerbuk, timbangan analitik, ayakan. 2. Alat pembuatan infusa daun M. tanarius Panci lapis aluminium, termometer, stopwatch, Beker glass, gelas ukur, cawan porselen, batang pengaduk, penangas air, timbangan analitik, kain flannel, waterbath. 3. Alat uji kadar ALT-AST Peralatan gelas, seperti Beker glass, labu ukur, batang pengaduk, gelas ukur, tabung reaksi, timbangan analitik, spuit injeksi per oral untuk tikus, spuit injeksi intraperitonial, pipa kapiler, mikro-vitalab 200, stopwatch, vortex, sentrifuge, Eppendorf.

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi daun M. tanarius

Determinasi daun M. tanarius dilakukan dengan cara mencocokkan ciri- ciri tanaman daun M. tanarius dengan menggunakan buku acuan determinasi Backer dan Bakhuizen van den Brink, 1963 hingga ke tingkat spesies dan disesuaikan dengan kunci determinasinya. Determinasi dilakukan oleh Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Pengumpulan bahan uji

Bahan uji yang digunakan pada penelitian ini adalah daun M. tanarius. Daun yang dipilih adalah daun yang masih segar dan berwarna hijau. Daun diperoleh dari Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, yang dipanen pada bulan Mei 2012.

3. Pembuatan serbuk kering daun M. tanarius

Daun M. tanarius yang telah dipetik dicuci dengan air mengalir dan diangin-anginkan hingga kering. Pengoptimalan pengeringan dilakukan dengan menggunakan oven pada suhu 50 C selama 24 jam. Daun yang telah kering kemudian diserbuk dengan alat penyerbuk. Setelah didapatkan serbuk kasar daun, dilakukan pengayakan dengan ayakan no.40 untuk mendapatkan serbuk daun M. tanarius yang lebih halus.

4. Penetapan kadar air serbuk kering daun M. tanarius

Serbuk kering daun M. tanarius yang sudah terayak, dimasukkan ke dalam alat moisture balance ± 5 g kemudian diratakan. Bobot serbuk kering daun tersebut ditimbang sebagai bobot sebelum pemanasan bobot A, setelah itu dipanaskan pada suhu 110 C. Serbuk kering daun M. tanarius yang sudah dipanaskan ditimbang kembali dan dihitung sebagai bobot setelah pemanasan bobot B. Kemudian dilakukan perhitungan terhadap selisih bobot A dan bobot B yang merupakan kadar air serbuk daun M. tanarius.

5. Pembuatan infusa daun M. tanarius

Serbuk kering daun M. tanarius ditimbang 100,0 g. Serbuk kering tersebut dimasukkan dan dicampur ke dalam 100,0 ml pelarut aquadest dan dua kali jumlah serbuk yang ditimbang, sehingga aquadest yang digunakan adalah 300,0 ml pada suhu 90 C dan dijaga tetap dalam suhu tersebut selama 15 menit. Waktu 15 menit dihitung ketika suhu campuran mencapai 90 C. Setelah 15 menit, campuran tersebut diambil dan diperas kemudian diuapkan di atas waterbath hingga didapatkan 100,0 g infusa daun M. tanarius.

6. Pembuatan larutan karbon tetraklorida konsentrasi 50

Berdasarkan penelitian Janakat dan Merie 2002, larutan karbon tetraklorida dibuat dalam konsentrasi 50 dimana perbandingan volume karbon tetraklorida dan pelarut adalah 1:1. Larutan karbon tetraklorida dibuat dengan cara dilarutkan dengan volume yang sama dengan olive oil.

7. Uji pendahuluan

a. Penetapan dosis hepatotoksik karbon tetraklorida Penetapan dosis hepatotoksik ini dengan melakukan studi literatur. Dosis hepatotoksin karbon tetraklorida yang digunakan untuk menginduksi kerusakan hati tikus jantan galur Wistar berdasarkan penelitian Janakat dan Merie 2002 adalah 2 mlkg BB. Pemilihan dosis hepatotoksik ini karena pada dosis tersebut dapat menyebabkan kerusakan sel-sel hati pada tikus jantan yang ditunjukkan dengan peningkatan ALT dan AST, tetapi tidak menyebabkan kematian pada tikus jantan. b. Penetapan waktu pencuplikan darah Untuk mendapatkan waktu pencuplikan darah dilakukan orientasi dengan tiga kelompok perlakuan waktu. Setiap kelompok terdiri dari 5 ekor tikus. Pengambilan darah dilakukan melalui sinus orbitalis mata. Kelompok I-III diambil darah masing-masing pada jam ke-0, 24, dan 48 setelah pemejanan karbon tetraklorida. Kemudian diukur aktivitas ALT dan AST. Penelitian terdahulu menunjukkan bahwa aktivitas ALT tikus terangsang karbon tetraklorida yang dilarutkan dalam olive oil volume 1:1 dengan dosis 2mlkg BB mencapai maksimal pada jam ke-24 setelah pemberiannya, kemudian pada jam ke-48 berangsur-angsur menurun Janakat dan Merie, 2002.

8. Pengelompokkan dan perlakuan hewan uji

Hewan uji yang dibutuhkan sebanyak 40 ekor tikus jantan yang dibagi secara acak dalam 8 kelompok sama banyak. Kelompok I kontrol hepatotoksin diberi karbon tetraklorida yang dilarutkan dalam olive oil volume 1:1 dengan dosis 2 mlkg BB secara intraperitonial. Kelompok II kontrol negatif diberi olive oil dosis 2 mlkg BB secara intraperitonial. Kelompok III kontrol infusa diberi infusa M. tanarius dosis 10 gkg BB yang diberikan selama 6 jam kemudian diambil darahnya. Kelompok IV-VIII kelompok perlakuan diberi infusa daun M. tanarius dosis 10 gkg BB, kemudian secara berturut-turut pada jam ke ½, 1, 2, 4, dan 6 setelah pemberian infusa diberikan dosis hepatotoksin karbon tetraklorida 2 mlkg BB. Pada jam ke-24 setelah pemberian karbon tetraklorida, semua kelompok diambil darahnya pada daerah sinus orbitalis mata untuk penetapan aktivitas ALT dan AST.

9. Pembuatan serum

Darah diambil melalui sinus orbitalis mata tikus dan ditampung dalam tabung Eppendorf dan didiamkan selama 15 menit, setelah itu disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 15 menit dan diambil supernatannya serum.

10. Pengukuran aktivitas ALT dan AST

Alat yang digunakan untuk pengukuran aktivitas ALT dan AST adalah micro-vitalab 200. Sebelum melakukan pengukuran sampel, alat divalidasi dengan menggunakan kontrol serum Cobas. Kisaran nilai ALT dan AST kontrol serum Cobas adalah 33,9-48,9 UL. Analisis fotometri ALT dilakukan dengan cara sebagai berikut, 100 µl serum dicampur dengan 800 µl reagen I, setelah itu dicampur dengan 200 µl reagen II, dan dibaca serapan setelah tiga menit. Untuk analisis fotometri dengan AST dilakukan sebagai berikut, 100 µl serum dicampur dengan 800 µl reagen I, kemudian dicampurkan 200 µl reagen II, dan dibaca resapan setelah tiga menit. Aktivitas ALT dan AST dinyatakan dalam UL. Aktivitas enzim diukur pada panjang gelombang 340 nm, suhu 37 C, dengan faktor koreksi -1745. Pengukuran aktivitas ALT dan AST ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

F. Tata Cara Analisis Hasil

Data aktivitas ALT dan AST yang diperoleh dianalisis dengan uji Kolmogorov Smirnov untuk melihat distribusi data tiap kelompok. Apabila didapat distribusi data yang normal maka analisis dilanjutkan dengan analisis pola searah One Way ANOVA dengan taraf kepercayaan 95 untuk mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe untuk melihat perbedaan masing-masing antar kelompok bermakna signifikan p0,05 atau tidak bermakna tidak signifikan p0,05. Namun bila didapatkan distribusi tidak normal, maka dilakukan analisis dengan uji Kruskal Wallis untuk mengetahui perbedaan aktivitas ALT dan AST antar kelompok. Setelah itu dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk mengetahui perbedaan tiap kelompok. Perhitungan persen efek hepatoprotektif terhadap hepatotoksin karbon tetraklorida diperoleh dengan rumus sebagai berikut. ୮୳୰ୟ୲ୟ ୅୐୘୅ୗ୘ ୩୭୬୲୰୭୪ ୩ୟ୰ୠ୭୬ ୲ୣ୲୰ୟ୩୪୭୰୧ୢୟି ୮୳୰ୟ୲ୟ ୅୐୘୅ୗ୘ ୮ୣ୰୪ୟ୩୳ୟ୬ ୮୳୰ୟ୲ୟ ୅୐୘୅ୗ୘ ୩୭୬୲୰୭୪ ୩ୟ୰ୠ୭୬ ୲ୣ୲୰ୟ୩୪୭୰୧ୢୟ ݔ 100 57

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Penyiapan Bahan 1.

Hasil determinasi tanaman Pada penelitian ini digunakan serbuk daun M. tanarius sebagai bahan uji. Tujuan dari determinasi tanaman adalah untuk membuktikan bahwa bagian dari tanaman yang digunakan benar berasal dari tanaman M. tanarius, sehingga tidak terjadi kesalahan dalam penyiapan bahan yang digunakan. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Determinasi tanaman ini dilakukan dengan cara mencocokkan ciri-ciri tanaman dari batang, daun, bunga, buah dengan buku acuan Backer dan Bakhuizen van den Brink, 1963 hingga ke tingkat spesies. Hasil dari determinasi membuktikan bahwa tanaman tersebut benar Macaranga tanarius L.

2. Penetapan kadar air serbuk kering daun M. tanarius

Penetapan kadar air bertujuan untuk mengetahui kandungan air dalam serbuk daun M. tanarius, sehingga dapat diketahui serbuk daun M. tanarius memenuhi persyaratan serbuk yang baik atau tidak. Syarat serbuk yang baik memiliki kadar air kurang dari 10 Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995. Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Gravimetri dengan menggunakan alat moisture balance. Serbuk dipanaskan di dalam alat pada suhu 110 C selama 15 menit, setelah itu dilakukan perhitungan terhadap kadar air yang diteliti. Hasil perhitungan menunjukkan bahwa serbuk daun M. tanarius memiliki kadar air 7,59. Hal ini menyatakan bahwa serbuk daun M.