17
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
b. Sterilisasi Media
Seluruh media pembenihan Nutrient Agar, Sabouraud Dextrose Agar disterilkan dengan autoklaf pada suhu 121
⁰C selama 15 menit.
3.3.6.2 Pembuatan Medium
1. Nutrien Agar NA
Serbuk NA sebanyak 28 gram dilarutkan dalam 1 liter akuades dan dipanaskan sampai mendidih sampai semuanya larut. Dibiarkan hingga membeku
lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 ⁰C selama 15 menit. Diuji
sterilisasinya, dimasukkan dalam inkubator selama 18 –24 jam suhu 37⁰C dan lihat
hasil sterilisasinya.
2. Sabouraud Dextrose Agar SDA
Sebanyak 65,0 gram medium disuspensikan kedalam 1 liter aquades. Medium dipanaskan sampai mendidih agar tercampur homogen. Kemudian
disterilisasi di dalam autoklaf selama 15 menit, pada suhu 118 ⁰-121⁰C, dan
ditunggu hingga dingin sekitar suhu 45-50 ⁰C. Lalu dituangkan 10-20 ml medium
ke dalam cawan petri.
3.3.6.3 Identifikasi Mikroba Uji
Dilakukan dengan cara melihat morfologi bakteri dan jamur dalam petri pembenihan dan secara mikroskopis :
1. Bakteri
Biakan Staphylococcus aureus ATCC 25925 umur 18-24 jam suhu 37
⁰C diambil menggunakan ose dan oleskan pada kaca objek. Tambahkan 1-2 tetes
Kristal violet biarkan selama 1 menit kemudian dibilas dengan air, tambahkan 1-2 tetes larutan lugol selama 1 menit, dibilas dengan air kemudian diteteskan alkohol
96 dan dibilas dengan air, diteteskan safranin biarkan selama 45 detik dan dibilas dengan air, kemudian dikeringkan kaca objek dekat nyala api, ditetesi
minyak imersi, diamati secara mikroskopik.
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Jamur
Biakan Mikrosporum canis diambil menggunakan ose dan oleskan pada kaca objek, tambahkan 1-2 tetes Lacto fenol catton blue, diamati secara
mikroskopik.
3.3.6.4 Pembuatan Larutan Uji
Pembuatan larutan uji dilakukan dengan cara menimbang 20 mg ekstrak dalam 5 mL etanol 70 yang merupakan larutan induk. Disiapkan 5 buah tabung
reaksi steril, masing-masing diisi dengan 1 mL etanol 70. Kedalam tabung reaksi 1 dimasukkan secara aseptis 1 mL larutan dengan konsentrasi 4000 ppm.
Kemudian diambil 1 mL larutan dari tabung reaksi 1 dan dimasukkan kedalam tabung reaksi 2, kedalam tabung reaksi 3 dimasukkan 1 mL larutan dari tabung
reaksi 2. Demikian secara berturut-turut hingga tabung reaksi 5. Jadi konsentrasi larutan uji yang diperoleh dari hasil pengenceran secara berturut-turut adalah
2000, 1000, 500, 250, 125 ppm.
3.3.6.5 Pembuatan Larutan Klotrimazol dari Krim X
Krim dengan berat 5 gram dimasukkan kedalam tabung sentrifus bertutup, dan ditambahkan 10 mL etanol mutlak. Kemudian dipanaskan dalam
penangas air pada suhu 50 ⁰C selama 5 menit sambil sekali-kali dikocok.
Kemudian tabung diangkat dan dikocok kuat-kuat selama 5 menit, dinginkan dalam lemari es selama 30 menit dan segera disentrifus. Beningan yang didapat
dipindahkan kedalam tabung reaksi. Pada residunya ditambahkan 10 mL etanol mutlak dalam tabung sentrifus, diulangi lagi ekstraksinya dan beningan yang
didapat dicampur dengan beningan hasil penyaringan pertama Depkes, 1995.
3.3.6.6 Peremajaan mikroba
1. Peremajaan Bakteri
Bakteri uji diremajakan dengan menggoreskan bakteri menggunakan ose pada media agar miring Nutrient Agar, kemudian diinkubasi pada suhu 37
⁰C selama 18-24 jam Poeloengan et al., 2006.
2. Peremajaan Jamur
Jamur diremajakan dengan menggoreskan jamur menggunakan ose pada media agar miring Sabouraud Dextrose Agar dan diinkubasi pada suhu ruang,
selama 2-3 hari.
