32 diujikan pada spot plate dengan menambahkan pereaksi Liebermen Buchard 3
tetes asam asetat anhidrida dan 1 tetes H
2
SO
4
pekat. Warna merah atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukkan adanya steroid.
3.5.4.5 Uji Tanin
Sebanyak 10 g simplisia ditambahkan air kemudian dididihkan selama beberapa menit, kemudian disaring. Filtratnya ditambah FeCl
3
1 bv. Warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin.
3.6 Identifikasi kandungan senyawa kimia ekstrak etanol sirih merah
Larutan ekstrak dielusi dengan kromatografi lapis tipis KLT dengan pengembang yang sesuai. Hasilnya dilihat secara visual dan di bawah sinar UV
254 dan 366 nm dengan atau tanpa pereaksi semprot Jork et al, 1990. Senyawa pembanding yang digunakan adalah quersetin dan rutin.
3.7 Suspensi ekstrak etanol sirih merah
Ekstrak sirih merah dibuat suspensi dengan menggunakan karboksil metil selulosa natrium CMC-Na konsentrasi 0,5. Konsentrasi ekstrak etanol sirih
merah dibuat sebesar 200 mgml.
3.8 Suspensi Obat Pembanding Metformin
Serbuk tablet metformin dari produksi PT Kimia Farma dibuat dalam larutan suspensi karboksil metil selulosa natrium CMC-Na konsentrasi 0,5.
Konsentrasi metformin dibuat dalam konsentrasi 0,1 dengan dosis pemberian
10 mgKg BB hewan uji Redy T.G, 2006. 3.9 Larutan Glukosa 50
Larutan D-Glukosa 50 gram dibuat dalam larutan aquadest 100 ml.
Pemberian dosis dilakukan dengan dosis 5 gKg BB hewan uji.
Universitas Sumatera Utara
33
3.10 Larutan Aloksan 5
Aloksan monohidrat 500 mg dilarutan dalam larutan fisiologis NaCl 0,9. Larutan selalu dibuat baru setiap pengujian. Dosis yang diberikan 200 mgkg BB
Tanquilut, et al, 2009.
3.11 Pengujian Antidiabetes 3.11.1 Obesitas Hewan Uji
Hewan uji dikondisikan dalam kandang. Makanan hewan diberikan dengan lemak tinggi dan gula tinggi. Selama pemeliharaan hewan diberikan
secara oral larutan makanan induksi selama 7 hari berturut-turut dengan dosis sesuai mencit dosis 1 BB. Makanan induksi dibuat dengan komposisi
modifikasi yaitu Lemak hewani sapi 20, kuning telur 20, fruktosa 10, glukosa 10 dan bahan tambahan lain hingga 100 Shafrir Eleazar, 2007.
Obesitas hewan uji dilakukan dengan membandingkan berat badan hewan uji dan
panjang hewan uji. 3.11.2 Uji Antidiabetes dengan Metode Uji Toleransi Glukosa
Mencit obesitas dipuasakan selama 18 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan diukur kadar gula darah puasa. Diberikan larutan glukosa dosis 5
gkg BB secara peroral. Setelah 30 menit ditentukan kadar gula darah mencit . Masing-masing mencit diberi Suspensi CMC dosis 1 BB sebagai
kontrol, suspensi ekstrak dalam 2 dosis 10, 100 dan 1000 mgkg BB dan suspensi obat pembanding metformin dosis 10 mgkg BB. Pengukuran kadar gula
darah dilanjutkan pada rentang waktu 60, 90, 120, 150, dan 180 menit. Pengukuran kadar gula darah dilakukan dengan menggunakan alat Accu trend
GCT Roche Adnyana I. Ketut, 2004.
Universitas Sumatera Utara
34
3.11.3 Uji Anti Diabetes pada Mencit Induksi Aloksan
Hewan yang diinduksi aloksan, terlebih dahulu digemukkan lalu diinjeksikan aloksan secara intra peritoneal ip. Makanan setelah diinduksi tetap
diberikan. Uji antidiabetes secara in vivo diacu berdasarkan metode yang dilakukan
Tanquilut et al 2009. Hewan coba dipuasakan ad libitium selama lebih kurang 18 jam. Kemudian berat badan ditimbang dan diukur kadar gula darah puasa
dengan alat Accu trend GCT Roche. Larutan aloksan 200 mgkg BB diberikan secara intra peritoneal i.p. Lalu diukur kadar gula darah mencit pada hari ke 3
dan ke 7. Pada hari ke 7, hewan yang memiliki kadar gula darah KGD lebih tinggi dari 200 mgdl dipisahkan dan dijadikan sebagai hewan uji. Hewan yang
memiliki KGD lebih rendah dari 200 mgdl diinduksi kembali. Jika hewan uji pada hari ke-7 telah menunjukkan kadar gula darah lebih dari 200 mgdl, maka
hewan sudah dapat diberikan bahan uji. Pengambilan darah dilakukan sebanyak 1 tetes melalui ekor mencit. Mencit dikelompokkan secara acak menjadi 6
kelompok, masing-masing terdiri dari 5 ekor mencit kemudian diberi perlakuan secara peroral.
Dosis pemberian suspensi uji: Kelompok I
: Mencit normal tanpa perlakuan, sebagai base line Kelompok II
: Mecit diabetes diberi suspensi 0,5 BB dari CMC 0,5, sebagai kontrol.
Kelompok III : Mencit diabetes diberi metformin dosis 10 mgkg BB.
Kelompok IV : Mencit diabetes diberi suspensi EEDSM dosis 50 mgkg BB.
Universitas Sumatera Utara
35 Kelompok V
: Mencit diabetes diberi suspensi EEDSM dosis 100 mgkg BB.
Kelompok VI : Mencit diabetes diberi suspensi EEDSM dosis 200 mgkg
BB. Kelompok VII
: Mencit yang telah diberi suspensi EEDSM dosis 100 mgkg BB selama seminggu, kemudian diinduksi aloksan.
Suspensi diberikan selama 11 hari berturut-turut secara oral. Lalu diukur kadar gula darah mencit pada hari ke-3, 5, 7 dan 11 setelah pemberian bahan uji.
Pada hari ke-11 hewan uji dibedah dan bagian organ pankreas digunakan untuk uji histol
ogi. Diamati sel pankreas dengan melihat jumlah dan diameter pulau langerhans pada masing-masing perlakuan. Selama percobaan juga diamati berat
badan hewan setiap pengukuran KGD dan berat kelenjar pankreas.
3.11.4 Uji Histologi Pankreas
Hewan uji dimatikan dengan cara dislokasi leher. Hewan yang telah mati diletakkan di atas papan fiksasi dengan perut mengarah ke atas. Pemotongan
dilakukan pada bagian kulit perut secara menyilang sampai terlihat bagian organ dalam perut mencit. Selanjutnya diambil organ pankreas mencit, lalu disimpan
dalam wadah khusus yang berisi formalin 10.
3.11.4.1 Pembuatan Sediaan Histologi Pankreas.
Setelah pankreas dikeluarkan dari tubuh mencit, dilakukan pembuatan preparat pankreas dengan langkah sebagai berikut: sampel pankreas yang telah
diambil lalu di fiksasi dengan larutan formalin 10 selama 3-4 jam. Setelah itu dilakukan dehidrasi dengan aseton sebanyak 3 kali, masing-masing selama 2 jam,
dilakukan cleaning pembersihan menggunakan toluen sebanyak 3 kali, masing-
Universitas Sumatera Utara
36 masing selama 1-2 jam, selanjutnya dilakukan proses embedding yaitu
perendaman sampel di paraffin cair dengan suhu 60 C sebanyak 3 kali, masing-
masing selama 2 jam, lalu dilakukan proses pencetakan blok paraffin. Blok parafin yang terbentuk diiris menggunakan alat mikrotom sehingga
menghasilkan lembaran yang ketebalannya 2 µm, lalu lembaran tersebut diletakkan di penangas air dengan suhu 30
C, lembaran yang telah direndam dalam penangas dilengketkan pada objek glas, lalu sampel tersebut dipanaskan di
oven selama 2-3 menit.
3.11.4.2 Pewarnaan
Sebelum pewarnaan, sampel yang telah dipanaskan di oven lalu direndam dalam xylol sebanyak 3 kali masing-masing selama 5-10 menit.
Selanjutnya dilakukan pencucianpembilasan menggunakan alkohol 90 selama 5-10 menit, lalu alkohol 80 selama 5-10 menit, dan kemudian alkohol 70
selama 5-10 menit. Setelah itu dilakukan proses pewarnaan menggunakan larutan haemotoxylin selama 2-3 menit dan dilanjutkan dengan larutan Eosin selama 2-3
menit. Kemudian sampel dicucidibilas menggunakan alkohol 70 selama 5-10 menit, lalu alkohol 80 selama 5-10 menit, dan kemudian alkohol 90 selama 5-
10 menit. Sampel dikeringkan pada suhu kamar selama 3-5 menit lalu ditutup dengan objek glass, lalu diamati di bawah mikroskop.
3.11.5 Penentuan dan Perhitungan Luas Pulau Langerhans Pankreas pada preparat sediaan
Penentuan anatomi pulau langerhans pankreas pada preparat histologi didasarkan pada gambaran anatomi seperti yang ditunjukkan oleh Lee et al., 2006.
Perhitungan luas pulau langerhans mengacu pada rumus bentuk oval yaitu sebagai berikut. Luas oval µm
2
= ½ π. jari-jari minor. jari-jari mayor.
Universitas Sumatera Utara
37 Jari-jari minor merupakan setengah diameter pulau langerhans yang lebih pendek
minor sedangkan jari-jari mayor merupakan setengah diameter pulau langerhans yang lebih panjang mayor.
3.12 Analisis Statistik
Analisis data menggunakan analisis ragam ANOVA rancangan acak lengkap RAL pada tingkat kepercayaan 80,
α=0,2 dan kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan. Semua data dianalisis dengan menggunakan program SPSS
19.
Universitas Sumatera Utara
38
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Sebanyak 8,5 kg daun sirih merah segar, setelah dibersihkan maka dimasukkan ke dalam lemari pengering, diperoleh simplisia kering sebanyak
823,5 g. Daun kering tersebut dihaluskan dengan menggunakan blender dan dimaserasi dengan etanol 70. Sehingga diperoleh ekstrak kental daun sirih
merah sebanyak 51,099 g dengan randemen 6,2 Gambar 4.1.
Gambar 4.1 Skema proses pembuatan ekstrak etanol sirih merah EEDSM dari
daun segar. A = daun segar, B = serbuk simplisia, dan C = ekstrak kental
4.1 Uji Fitokimia
Hasil skrining EEDSM menunjukkan adanya senyawa alkaloid, flavonoid, steroid, dan taninfenol Tabel 4.1. Kandungan senyawa tersebut
memiliki kesamaan dengan yang dilakukan oleh Agus 2006, kecuali senyawa steroid. Hal tersebut karena proses penyarian yang dilakukan Agus menggunakan
air rebusan sehingga besar kemungkinan steroid tidak tersari ke dalam air, sedangkan penyari etanol 70 akan menarik senyawa steroid.
A B
C
Universitas Sumatera Utara
