Penambahan Spirulina didasarkan pada perhitungan jumlah kalori dan serving size takaran saji ketika mengkonsumsi snack atau makanan ringan satu
kali dalam sehari, serta jumlah Spirulina yang dianjurkan dikonsumsi dalam satu hari. Serving size merujuk pada takaran saji salah satu biskuit komersial merk X.
3.4 Prosedur analisis
Analisis yang dilakukan untuk mendapatkan formula biskuit Spirulina terpilih yaitu antioksidan dan nilai hedonik. Analisis yang dilakukan pada biskuit
berbasis Spirulina hasil kultivasi yaitu analisis proksimat kadar air, abu, protein, lemak dan analisis antioksidan. Biskuit Spirulina tersebut kemudian disimpan
selama satu bulan pada suhu ruang dengan kemasan plastik jenis HDPE High Density Polyethylen. Analisis Total Plate Count TPC dan pengukuran aktivitas
air a
w
dilakukan selama penyimpanan pada hari ke-1, hari ke-16, dan hari ke-31. 3.4.1 Kadar air AOAC 2005
Cawan kosong dikeringkan pada suhu 105°C selama 30 menit, didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang hingga beratnya konstan.
Sejumlah 5 gram sampel dimasukkan dalam cawan, kemudian dipanaskan menggunakan oven bersuhu 105°C selama 6 jam, kemudian didinginkan dalam
desikator selama 30 menit dan ditimbang hingga diperoleh bobot tetap. Kadar air dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut :
Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan sampel gram
C = Berat cawan dan sampel setelah dikeringkan gram 3.4.2 Kadar abu AOAC 2005
Cawan dikeringkan pada suhu 105°C selama 30 menit, didinginkan dalam desikator, kemudian ditimbang hingga beratnya konstan. Sebanyak 5 gram sampel
dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui bobotnya. Cawan dipijarkan dalam tungku pengabuan bersuhu sekitar 105°C sampai tidak berasap. Selanjutnya
cawan tersebut dimasukkan ke dalam tanur pada suhu 600°C selama 6 jam. Proses pengabuan dilakukan sampai abu berwarna putih. Setelah itu cawan
didinginkan dalam desikator selama 30 menit, kemudian ditimbang beratnya. Kadar abu dapat dihitung dengan menggunakan rumus berikut :
Keterangan: A = Berat cawan kosong gram B = Berat cawan dengan sampel gram
C = Berat cawan dan sampel setelah dikeringkan gram 3.4.3 Kadar protein AOAC 2005
Prinsip dari analisis protein yaitu untuk mengetahui kandungan protein kasar crude protein pada suatu bahan. Tahap-tahap yang dilakukan dalam
analisis protein terdiri dari tiga tahap, yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. 1
Tahap destruksi Sampel ditimbang seberat 1 gram, kemudian dimasukkan ke dalam tabung
Kjeltec. Setengah butir Kjeltab dimasukkan ke dalam tabung tersebut dan ditambahkan 10 ml H
2
SO
4.
Tabung yang berisi larutan tersebut dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 400°C. Proses destruksi dilakukan kurang lebih
satu jam dan sampai larutan menjadi hijau bening. Setelah sampel dan larutan memadat, kemudian dicairkan dan ditepatkan dengan akuades sampai 100 ml.
2 Tahap destilasi
Larutan hasil destruksi sebanyak 10 ml dituangkan ke dalam labu destilasi, lalu ditambahkan larutan NaOH 40 sebanyak 10 ml. Cairan dalam tabung
kondensor ditampung dalam erlenmeyer 250 ml berisi 10 ml larutan asam borat yang ada dibawah kondensor. Destilasi dilakukan sampai larutan asam borat yang
berwarna merah menjadi warna biru dalam waktu ±15 menit. 3
Tahap titrasi Titrasi dilakukan dengan menggunakan HCl 0,1028 N sampai terjadi
perubahan warna menjadi merah warna asam borat semula. Perhitungan jumlah nitrogen dalam bahan dihitung dengan menggunakan rumus :
Kadar protein = Nitrogen x faktor konversi 6,25
3.4.4 Kadar lemak AOAC 2005 Sampel sebanyak 5 gram W1 dimasukkan ke dalam kertas saring dan
dimasukkan ke dalam selongsong lemak, kemudian dimasukkan ke dalam labu lemak yang sudah ditimbang berat tetapnya W2 dan disambungkan dengan
tabung soxhlet, kemudian disiram dengan pelarut lemak. Tabung ekstraksi dipasang pada alat destilasi soxhlet, lalu dipanaskan pada suhu 40°C dengan
menggunakan pemanas listrik selama 6 jam. Pelarut lemak yang ada dalam labu lemak didestilasi hingga semua pelarut lemak menguap. Pada saat destilasi pelarut
akan tertampung di tabung soxhlet, pelarut dikeluarkan sehingga tidak kembali ke dalam labu lemak, selanjutnya labu lemak dikeringkan dalam oven pada suhu
105°C, lalu labu didinginkan dalam desikator sampai beratnya konstan W3. Kadar lemak sampel dapat dihitung menggunakan rumus sebagai berikut :
Keterangan: W1 = berat sampel gram W2 = berat labu lemak tanpa lemak gram
W3 = berat labu lemak dengan lemak gram 3.4.5 Analisis aktivitas air a
w
Aktivitas air a
w
dari produk diukur dengan menggunakan alat a
w
meter, dengan spesifikasi alat adalah a
w
meter Novasina ms1. Alat tersebut terlebih dahulu dikalibrasi dengan menggunakan garam jenuh MgCl
2
, MgNO
3 2
, NaCl, LiCl, dan BaCl
2
. Sejumlah sampel diletakkan ke dalam cawan plastik, kemudian cawan tersebut dimasukkan ke dalam cawan pengukur lalu ditutup dan dikunci.
Alat a
w
meter dioperasikan sampai menunjukkan tanda selesai, selanjutnya nilai a
w
akan terbaca. 3.4.6 Analisis Total Plate Count TPC BSN 2006
Penghitungan total mikroba dilakukan dengan analisis Total Plate Count TPC dengan metode agar tuang. Prinsip metode ini adalah bakteri mesofil aerob
akan tumbuh dengan baik setelah sampel diinkubasi selama 24-48 jam. Sel bakteri akan tumbuh membentuk koloni yang dapat dilihat secara visual, sehingga dapat
langsung dihitung. Mula-mula cawan petri, tabung reaksi, dan pipet disterilisasi dalam oven pada suhu 150°C selama 2 jam. Media Plate Count Agar PCA
dibuat dengan cara melarutkan 3,5 gram PCA dalam 200 ml akuades. Media
tersebut disterilkan dalam autoklaf bersuhu 121°C selama 15 menit dengan tekanan 1 atm. Selanjutnya suhu media dipertahankan pada 45-55°C dalam
penangas air untuk menjaga agar media tidak membeku. Pembuatan larutan pengencer garam fisiologis dengan cara melarutkan 8,5 gram NaCl dalam 1 liter
akuades yang kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121°C dan tekanan 1 atm selama 15 menit.
Sebanyak 10 gram sampel dihaluskan lalu dilarutkan dalam 90 ml larutan garam fisiologis sehingga didapatkan pengenceran 10
-1
. Larutan tersebut kemudian dipipet 1 ml, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah
berisi 9 ml larutan garam fisiologis steril untuk memperoleh pengenceran 10
-2
, demikian seterusnya hingga diperoleh pengenceran 10
-5
. Sebanyak 1 ml dipipet dari masing-masing pengenceran, lalu dimasukkan ke dalam cawan petri steril.
Setiap pengenceran dilakukan duplo. Plate Count Agar PCA kemudian dituangkan hingga merata ke dalam cawan petri. Cawan petri tersebut kemudian
digerakkan di permukaan yang rata dengan gerakan melingkar agar media PCA merata. Setelah PCA membeku, cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik
dalam inkubator pada suhu 30°C selama 48 jam. Koloni yang tumbuh pada cawan petri dapat dihitung dengan jumlah koloni yang diterima 25-250 koloni per cawan.
Nilai TPC dapat dihitung dengan memakai rumus berikut :
Data yang dilaporkan sebagai Standar Plate Count SPC harus mengikuti syarat-syarat sebagai berikut :
1 Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka, yaitu angka pertama dan
kedua. Jika angka ketiga sama dengan atau lebih besar dari lima, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi dari angka kedua.
2 Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan kurang
dari 25 koloni, hanya koloni pada pengenceran terendah yang dihitung, hasilnya dilaporkan sebagai kurang dari 25 dikalikan dengan faktor
pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan. 3
Jika semua pengenceran yang dibuat untuk pemupukan menghasilkan lebih dari 250 koloni, hanya jumlah koloni pada pengenceran tertinggi yang
dihitung. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 250 dikalikan dengan faktor pengenceran.
4 Jika cawan dari dua tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah
antara 25-250, dimana perbandingan antara jumlah koloni tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut lebih dari satu atau sama dengan
dua, maka tentukan rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika perbandingan antara nilai tertinggi
dan nilai terendah lebih besar dari dua, maka yang dilaporkan hanya hasil nilai terkecil.
5 Jika digunakan dua cawan petri duplo pengenceran, data yang diambil harus
dari kedua cawan tersebut. 3.4.7 Analisis antioksidan Molyneux 2004
Sampel biskuit 0,02 gram dilarutkan dengan methanol sampai 20 ml untuk membuat stok 1000 ppm. Kemudian diambil sebanyak 2 ml, 4 ml, 6 ml, dan 8 ml
dari stok 1000 ppm tersebut, lalu dilarutkan dengan methanol sampai 10 ml untuk membuat larutan 200 ppm, 400 ppm, 600 ppm, dan 800 ppm. Pengukuran
aktivitas antioksidan dilakukan dengan penambahan DPPH 2,2-DiPhenyl-1- Picryl-Hydrazyl. Sebanyak 2,25 ml dari masing-masing larutan campuran sampel
dan methanol dicampur dengan 0,25 ml DPPH, kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit, lalu diukur absorbannya dengan menggunakan
spektometer pada panjang gelombang 517 nm. Larutan sampel dan DPPH sebaiknya tidak terpapar cahaya. Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam bentuk
persentase penghambatan terhadap radikal DPPH dengan rumus sebagai berkut:
Nilai konsentrasi sampel ppm dan persen inhibisinya diplot masing- masing pada sumbu x dan y pada persamaan regresi linear. Persamaan regresi
linear yang diperoleh dalam bentuk persamaan y = a + bx, digunakan untuk mencari nilai IC
50
Inhibitor Concentration 50 dari masing-masing sampel, dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x yang akan diperoleh sebagai
IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan besarnya konsentrasi larutan contoh yang dibutuhkan untuk mereduksi radikal bebas DPPH sebesar 50.
3.5 Uji hedonik BSN 2011
